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westen相关步骤
通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测,蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,可检测到低至1~5ng(最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白.
一,抗原的选择和制备
A:
样品的制备
1组织:
组织的处理方法:
组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS,0℃研磨,加入5×STOPbuffer,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins离心,取上清.加入β-ME(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样.
2细胞:
细胞的处理方法:
离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOPbuffer,收集,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins离心,取上清.加入β-ME(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样.
3分泌蛋白的提取(特例):
直接收集分泌液,加入β-ME,溴酚蓝制样.
B:
蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法:
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法.在需要快速,但不很准确的测定中,常用此法.硫铵不干扰显色,这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的.双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收.双缩脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如Tris,Good缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定.
2.Lowry法:
此法是双缩脲法的进一步发展.他的第一步就是双缩脲反应,即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物,然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂(福林-酚试剂),结果得到深蓝色物.此法比双缩脲法灵敏得多,适合于测定20mg/L~400mg/L含量的蛋白质溶液.其干扰物质与双缩脲法相同,而且受他们的影响更大,硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差.另外要注意的是,加入福林试剂时要特别小心,试剂只在酸性pH环境中才稳定,上述提到的还原反应只有在pH10时才发生,因此,福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时,必须立刻搅拌,以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原.
3.紫外吸收法:
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,因此,利用这个特异性吸收,可以计算蛋白质的含量.如果没有干扰物质的存在,在280nm处的吸收可用于测定0.1~0.5mg/ml含量的蛋白质溶液.部分纯化的蛋白质常含有核酸,核酸在260nm波长处有最大吸收.有核酸时,所测得的蛋白质浓度必须作适当校正,一般按下述公式粗略计算:
是蛋白质溶液在280nm波长处(光程1厘米)测得的光密度值.是蛋白质溶液在260nm小波长处(光程1厘米)处所测得的光密度值.
此方程是从烯醇酶(在酵母核酸存在时)得出来的.因此,对其他蛋白质和其他核酸不一定适用.由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同,因此,浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数()在0.5~2.5之间变化.
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收.例如,牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7,而在280nm处测为0.58.在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在,因此,此值对所有的蛋白质都是一样的.从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml~100μl/ml的蛋白质.蛋白质浓度可以近似地由下式得到:
光密度之差求
得,这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差.但是,蛋白质之间的分子量差异比较大,因此,在比较几种蛋白质含量时,必须作适当的校正.由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化,所以在制作标准曲线时,必须与样品条件一致.
4.Bradford比色法:
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速.用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油,去污剂,2-巯基乙醇,乙酸,硫酸铵,Tris和一些碱性缓冲系统的干扰.
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白(5,10,15和20l),以0.15mmol/lNaCl补足至100l,同时以两管100l的0.15mmol/lNaCl作空白对照.每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液,振荡混匀,室温放置2分钟.用1cm光径的微量比色杯测A595,取A595吸光值对标准蛋白浓度作图,画标准曲线,并测量待测样品的A595.从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度.测定10-100g的蛋白质,要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行.样品浓度过高,可稀释后进行,或在10-100g另作一标准曲线进行测定.
5.电泳估算法(我们选择此法):
样品倍比稀释,SDS-PAGE电泳,同时做定量marker对照,可以估算样品大概浓度.
以提取癌组织总蛋白为例:
①取等量胰腺癌组织,癌旁组织及正常胰腺组织,用dH2O漂洗5~10次,再用预冷的1×PBS洗涤3次,目的是去除样本中的血液.
②每2克组织加入3ml1×PBS匀浆,保持在4℃条件进行.
③加入5×STOPBuffer缓冲液1ml,混匀,4℃下超声碎化.再加入0.5mlβ-ME,0.5ml溴酚蓝,煮沸10mins,至此,制样过程完成;
④SDS-PAGE电泳,以BAS作为对照估计样品蛋白浓度.
二,SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
A:
实际操作
做胶前的准备
1)检查是否有足够的,干净的spacer,comb和架子.
2)检查是否有新鲜的,足量10%APS,没有立刻重配.
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小,计算出胶的浓度,并算出分离胶各组分的用量.
制胶,电泳
1)装好架子.
2)按照下面配方配制分离胶.(单位:
ml,Total:
8ml)
7.5%
10%
15%
2×Sep.buffer
4
4
4
30%Gel.sol
2.0
2.7
4
ddH2O
1.9
1.2
0
TEMED
8ul
8ul
8ul
10%APS
80ul
80ul
80ul
在胶上面加入一层蒸馏水,促进胶更好的凝集.
3)待分离胶凝集后,配制浓缩胶.(单位:
ml,Total:
3.5ml)
3%
2×Stacking.buffer
1.7
30%Gel.sol
0.35
ddH2O
1.4
TEMED
5ul
10%APS
50ul
倒好后插入预先准备好的梳子.
4)待胶凝集好后,上样,电泳.上层胶用60-80V电压,当样品至分离胶时,用100-120V电压.一般电泳时间在1.5小时左右.
B:
注意事项及常遇到的问题
1)分离胶不要倒的太满,需要有一定的浓缩胶空间,否则起不到浓缩效果.
2)上样蛋白量不应超过30ug/mm2(载荷面即:
如果你的胶槽是5mm×1mm,则载荷面为:
1mm×5mm=5mm2).
3)gel通常在0.5-1h内凝集最好,过快表示TEMED,APS用量过多,此时胶太硬易龟裂,而且电泳时容易烧胶.太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效.
4)混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合,导致电泳带畸形.太慢不均匀,特别是甘油.
5)电泳中常出现的一些现象:
)条带呈笑脸状,原因:
凝胶不均匀冷却,中间冷却不好.
(条带呈皱眉状,可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全.
拖尾:
样品溶解不好.
纹理(纵向条纹):
样品中含有不溶性颗粒.
条带偏斜:
电极不平衡或者加样位置偏斜.
条带两边扩散:
加样量过多.
三,转移
在电流的作用下,使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上.
膜的选择:
印迹中常用的固相材料有NC膜,DBM,DDT,尼龙膜,PVDF等.我们选用PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附,物理强度,以及具有更好的化学兼容性.有两种规格
mmobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa).
A半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间,通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流,起到转移的效果.因为电流直接作用在膜胶上,所以其转移条件比较严酷,但是其转移时间短,效率高.
1实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2,我们通常100mA/膜,按照目的蛋白分子大小,胶浓度选择转移时间,具体可以根据实际适当调整.
目的蛋白分子大小(kDa)
胶浓度
转移时间
80---140
8%
1.5-2.0
25---80
10
1.5
15--40
12
0.75
=膜>=胶.
2)滤纸,胶,膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路.
3)因为膜的疏水性,膜必须首先在甲醇中完全浸湿.而且在以后的操作中,膜也必须随时保持湿润(干膜法除外).
4)滤纸可以重复利用,上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质,所以上下滤纸一定不能弄混,在不能分辨的情况下,可以将靠胶滤纸换新的.
5)转移时间一般为1.5小时,(1mA-2mA/cm2,10%gel),可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.
B湿法
我们基本上不用此方法,这里暂不做介绍.
C转移后效果的鉴定
1.染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后,看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果.
2.染膜
有两类染液选择,可逆的和不可逆的.可逆的有ponceau-sred,FastgreenFC,CPTS等,这类染料染色后,色素可以被洗掉,膜可以用做进一步的分析用.但是不可逆的染料,如考马斯亮兰,indiaink,Amido.black10B等,染色后膜就不能用于进一步的分析.
四,封闭(block)
封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合.
常用的封闭液有bovineserumalbumin(BSA),non-fatmilk,casein,gelatin,tween-20等,我们一般用non-fatmilk.
在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解).转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里,避免污染而且要足以覆盖膜),并清洗整理好用过的滤纸,以便下次使用.Block4°CO/N,或RT1小时.
五,孵育一抗
先将需要检测的抗体准备好,并决定好它们的稀释度.
配好5%的Milk(TBST溶解),按要求稀释好抗体.注意,如需高比例稀释,
最好采用梯度稀释.
将稀释好的抗体和膜一起孵育.一般采用RT1小时,可根据抗体量和膜上
抗原量适当延长或缩短时间.
注意:
为了便于后面分析结果,我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育.
六,洗涤
用TBST先快速洗三次,把milk尽快的wash掉.然后5mins*5.
洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅.
七,孵育二抗
孵育RT1小时.一般采用HRP标记的二抗,稀释比例为1:
5000.
二抗的稀释比例不能太低,否则容易导致非特异性的结合.
注意二抗的选择有多种,要根据一抗来选择抗兔,抗鼠或者抗羊的二抗,以及根据后面的显色条件来选择HRP,AP或者GOD(葡萄糖氧化酶)酶链的二抗或者标志其他探针(如核素等)的.
八,洗涤
用TBST先快速洗三次,把milk尽快的wash掉.然后5mins*5.
洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅,所以洗涤一定要干净.
九,显色(HRP酶)
1.增强化学发光法(ECL)
Ecl显色原理:
氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物,是最常用的一类化学发光剂.鲁米诺(luminol,5'-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)的分子结构及化学反应式如下:
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物,也可用作过氧化物酶的底物.在Ecl底物中,含有H2O2和鲁米诺,在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下,发出荧光来.
试验步骤:
1)将两种显色底物1:
1等体积混合(一般各1ml/membrane).
2)将混合物覆盖在膜表面,1-2分钟,摇晃使均匀.
3)用保鲜膜把膜包起来,放入夹板中.
4)在暗室中将X光片,覆盖在膜的上面,夹好夹子,曝光1min.
5)显影,定影.
6)根据结果调整曝光时间和曝光区域,得到最佳结果.
注意:
荧光在一段时间后会越来越弱.
2.DAB显色
DAB(3,3二氨基联苯胺)和HRP反应产生棕色的不溶终产物.这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂,对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想.
对于AP标记的二抗我们选用BCIPandNBT显色,它们在碱性磷酸酶(AP)作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号.
十,分析结果及其判断
常见问题原因分析及处理方法:
见附录一,二.
附录一:
TroubleshootingBlottingProblems(P43-48)
附录二:
WesternBlottingTroubleshootingLogicTree(P390-394)
附录三:
试验中所用到的试剂和缓冲溶液
5xStopSolution(Samplebuffer)pH6.7:
Stock:
touse:
20%Glycerol100mltake9.5mlstock
10%SDS50gor250ml20%SDSaddBME0.5ml
250mMTris15.14gbromphenolblueor
total475.00mlpyronine4totaste
2)Gelsolution(30%w/vacrylamidemix):
0.8bis-acrylamide0.8g
29.2%acrylamide29.2g
total100ml
3)2xLaemmliSeparationBuffer:
0.75MTris-HCl90.825g
0.2%SDS10ml20%SDS
total1000ml
pH8.8
4)2xLaemmliStackingBuffer:
0.25MTris15.14g
0.2%SDS1g
total500ml
pH6.8
5)10xLaemmliRunningBuffer:
250mMTris60.55g
1.9MGlycine285.27g
1%SDS20g
total2liters
pH8.3
6)TransferBuffer:
48mMTrisbase5.81g
39mMGlycine2.93g
0.037%SDS0.375g
20%MeOH200ml
total1000ml
7)TBST:
10mMTris-HCl,1.21g
100mMNaCl
0.2%Tween-20
Total1000ml
pH7.4
8)CoomassieStain:
40%MeOH400ml
10%HAc100ml
0.1%BBR1gBrilliantBlueR
total1000ml
9)Destain:
30%MeOH300ml
7.5%HAc75ml
total1000ml
10)10×丽春红染液配方:
丽春红2g
磺基水杨酸30g
三氯醋酸30g
total100ml
11)DAB
DAB50mg
0.05mol/LTB(PH7.6)100ml
30%H2O230-40ul
先配成2-5倍的储存液,过滤后分装,-20℃避光保存,H2O2在工作液中终浓度0.01%.
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自我总结的WestenBlot步骤,简单实用!
蛋白质的提取
(整个过程冰上进行)
一.组织膜蛋白
裂解液bufferA+1%蛋白酶抑制剂
蛋白保存液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中(研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗,用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨(研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗,用纸吸干水)
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心,1500转15min
3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中(离心管事先用去离子水冲洗)用裂解液配平
4.差速离心33000-35000转(45000g)30min
5.弃上清,沉淀加入150μl左右蛋白保存液(根据沉淀的量调整)用枪来回吹打使沉淀溶解,枪头在液面下,尽量不要出沫
6.将上述液体分装到0.5ml离心管中,每管20-25μl,留一管-20°C保存测浓度,其余放入-80°C保存
二.组织总蛋白
裂解液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中(研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗,用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨(研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗,用纸吸干水)
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心,13500转30min
3.取上清分装到0.5ml离心管中,每管20-25μl,留一管-20°C保存测浓度,其余放入-80°C保存
三.细胞总蛋白
裂解液RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.将培养瓶中培养液倒掉,加入PBS冲洗5-6遍,倒掉PBS,用枪吸出倒不尽的PBS
2.每瓶加100-150μl裂解液,用细胞刮刀尽量将细胞刮下来(刮刀用前去离子水冲洗,用纸吸干水,用完一样处理)用200枪转入1.5ml离心管中
3.超声破碎细胞,频率80-100间,超声探头(用前用纸擦,用后用纸擦并盖上盖)插入液面下,超声3-5s停3-5s,总共20s左右,停止5min左右
4.重复上步4-6次
5.4°C离心13500转15min
6.取上清分装到0.5ml离心管中,每管40μl,留一管-20°C保存测浓度,其余放入-80°C保存。
蛋白质浓度的测定
工作液(BCA试剂B液:
BCA试剂A液=1:
50)
1.用100枪将19μlPBS加入96孔板(两边不加,测浓度不准)
2.用2.5枪加入1μl待测样品(加样时枪头在液面下,提抢时贴壁,尽量不产生气泡)
3.用200枪加入200μl工作液,混匀(枪头在液面下,不产生气泡)
4.放入37°C孵箱30min
5.用酶标仪测浓度,记录数据
凝胶的配置
一.分离胶的配置:
1.将胶板用自来水冲洗干净(否则配出的胶会不均匀),用去离子水冲洗。
将胶板固定在架子上,加入去离子水至矮板高度,等待3~4分钟,测试是否漏水。
期间可以准备配胶时所需要的溶液:
去离子水:
室温放置
30%丙烯酰胺:
4℃放置,神经毒性
TRIS—HCL(ph8.8):
4℃放置
TRIS—HCL(ph6.8):
4℃放置
10%SDS(自配):
室温放置
10%AP(现配现用):
避光
TEMED:
室温放置,神经毒性
2.根据所需蛋白质的分子量确定所要配制多大浓度的胶。
本实验采用的胶为10%的分离胶,2块胶版配置25ml即可。
按照如下的量进行配制分离胶:
去离子水:
9.9ml
30%丙烯酰胺:
8.3ml
TRIS—HCL(ph8.8):
6.3ml
10%SDS(自配):
0.25ml
10%AP(现配现用):
0.25ml
TEMED:
0.01ml
配置时要将液体混匀,加入最后两种物质的速度要快,因为丙烯酰胺是促凝剂,凝聚的物质为APH和TEMED。
将配好的分离胶倒入胶板中(倒入量为胶板高度的3/4)加入去离子水封住,防止空气进入,排除气泡。
加去离子水时要轻,防止将上层的分离胶稀释。
通常分离胶需要30~35分钟即可,凝固后可以看到用一条直线。
3.在配好的分离胶上层加入TRIS—HCL(ph6.8)作为一种缓冲,因为积层胶用的是TRIS—HCL(ph6.8)。
然后配制积层胶:
去离子水:
5.5ml
30%丙烯酰胺:
3.5ml
TRIS—HCL(ph6.8):
1.5ml
10%SDS(自配):
0.08ml
10%AP(现配现用):
0.08ml
TEMED:
0.008ml
配好后将TRIS—HCL倒出,倒入积层胶,插入梳子(梳子要用去离子水冲洗干净,并将去离子水甩掉,否则会在胶板上留下不能用的孔道),插梳子的时候要排除气泡,从一端向另一端推。
20分钟即可凝固,拔出梳子。
将配好的胶板放入装有去离子水的饭盒中,防止胶中的水分蒸发,发生缩胶现象。
电泳液和转膜液的配制
1.电泳液:
Gly15.0g,Tris-base3.02g,SDS1g,1000ml去离子水,室温保存
2.转膜液:
Gly14.4g,Tris-base3.00g,甲醇100ml,900ml去离子水,4℃保存
蛋白质样本的处理
1.从-80℃冰箱中取出提好的蛋白质,按照算好的蛋白,ripa,loading将蛋白稀释到同一个体积。
(此操作过程在冰域中进行)
蛋白质的体积X=40μg/[(1.3484*OD值-0.0799)*20]
Ripa的体积Y=体积最大的蛋白质补整-X
Loading的体积Z=1/4(X+Y)
2.煮样:
100℃,5min。
(将管外的水擦干净)
电泳过程
1.将电泳槽准备好,胶板的矮面朝里,加入电泳液,先在里面和外面个加入一半的电泳液,排净气泡后加满。
2.上样,上样量为8μl。
上样时要慢,如果担心样的中央处有凹陷,那就在边处让样流下。
3.按照“红对红,黑对黑”的原则安装电极。
开始跑电泳。
先恒压70v使蛋白质跑到同一条起跑线上,待跑至分离胶上时,改为100v,使溴酚蓝全部跑出时停止。
电压越小跑的越好。
转膜过程
1.剪好滤纸和NC膜,滤纸要比膜小1~2cm,在转膜液中浸泡。
2.准备白色的矮一些的盒子,里面装好转膜液,将膜取下,取得过程中要注意不要将膜弄破。
3.制作“三明治”,夹板黑色的一面朝向桌子,第一层为海绵,第二层为滤纸,第三层为胶,第四层为滤纸,这时不要急于将最后一层海绵盖上,先将前面三层中的气泡赶走,然后再加入第五层海绵。
夹紧,不要让夹板扭动。
4.放入“三明治”时要按照“黑对黑”的原则放入。
在倒满转膜液之前不要忘记将一个冰盒放在转膜槽内。
将转膜槽放在装满冰的盆里,开始转膜。
我们需要的分子量范围是:
>250kd~31kd,我们转膜的条件为恒压70v,2h。
封闭
1.封闭液的配制(5%):
将10g脱脂奶粉加入到200mlPBS中,在漏斗中过滤。
2.将膜取出,放在去离子水中冲洗一下,放入封闭液中。
3.放在摇床上封闭2h。
一抗的孵育
1.将膜从封闭液中取出,用PBS冲洗3次,每次10min。
按照分子量将膜剪开。
2.一抗有两种孵育方法:
一、室温孵育:
在桌面上铺一张纸,将剪好的膜放在纸上,加上相应的一抗。
二
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