菌体表面基团的定量测定.docx
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菌体表面基团的定量测定
面包酵母菌和枯草芽胞杆菌表面功能基团的定量测定
化学生物学2005级郑飞
指导老师赵茂俊教授
摘要:
本次研究利用酸碱滴定技术和红外光谱测试技术对面包酵母菌、乙醇修饰面包酵母菌和枯草芽孢杆菌的表面性质进行了表征。
应用Protofit软件计算出菌体在表面反应中起主要作用的4种基团的pKa分别为(4.43,3.65,4.239)、(6.77,6.25,6.15)、(9.89,9.00,9.00)和(9.8,9.65,10.64),并与文献中的数据进行比较初步推断出这些基团为羧基、磷酸基团、胺基及羟基,菌体的红外光谱解析进一步验证了这一结果。
所得结论为后续研究生物吸附中菌体与吸附质之间的作用提供了重要依据。
关键词:
面包酵母菌,枯草芽孢杆菌,表面基团,酸碱滴定,红外光谱
QuantitativeDeterminationofSaccharomycescerevisiaeandBacillussubtilis(Ehrenberg)surfacefunctionalgroups
ZHENGFeiChemicalBiology,Grade2005
DirectedbyZHAOMao-jun(Prof.Ph.D)
Abstract:
ThesurfacepropertiesofSaccharomycescerevisiae,ethanolmodifiedSaccharomycescerevisiaeandBacillussubtilis(Ehrenberg)werestudiedbyusingacid−basetitrationandFTIR.Inaddition,Protofit,ausefulsoftware,wasusedtofittheacidbasetitrationdatatoquantifytheactivesurfacefunctionalgroupsonthethreebiomasses.Theresultsshowedthatfouractivegroupscoexistedatthesebiomassessurface.TherespectivedeprotonationconstantwaspKa(4.43,3.65,4.239),(6.77,6.25,6.15),(9.89,9.00,9.00)and(9.8,9.65,10.64),correspondingtocarboxylgroups,phosphategroups,aminegroupsandhydroxylgroups.TheresultswerefurtherverifiedbyFTIRanalysisofsamples.Thestudiesofsurfacepropertiesofbiomassprovidesomeimportantinformationabouttheinteractionbetweenbiomassandadsorbate.
Keywords:
Saccharomycescerevisiae,Bacillussubtilis(Ehrenberg),surfacegroups,acid−basetitration,FTIR
1前言
现代工业作为我国的重要产业,发展迅速。
但是这些工业中(矿冶、机械制造、化工、电子、仪表、染料工业、纺织印染业等)许多生产过程会产生含大量重金属离子和染料的废水。
这些废水如果未经处理排放到环境中,将引起环境和生态恶化,严重威胁着人类和其它生物的生存和发展。
据统计,我国水体重金属污染问题十分突出,而治理很低,江河湖库底质的污染率高达80.1%。
重金属具有毒性大,在环境中不易被代谢,易被生物富集并有生物放大效应等特点,不但污染水环境,也严重威胁人类和水生生物的生存。
而印染废水每天排放量为300~400万立方米,治理率也仅为30%,许多印染废水来不及处理就直接排入天然水体中,对生态环境造成了巨大的影响[1]。
且染料逐渐朝着难光解、难氧化、难生物降解的方向发展,给染料废水的处理造成了很大的困难,常规的物理化学方法和生化方法往往难以有效的去除染料。
近年来提出了许多改进的物化方法虽然提高了处理效率,但其昂贵的成本及运行费用阻碍了其广泛应用。
利用生物治理重金属污染和染料污染由于其成本低,效率高等特点成为水污染控制中的研究热点。
生物吸附是在细胞表面上发生的一系列过程,包括物理化学的吸附作用、静电作用、离子交换、复合作用和螯合作用等[2]。
菌体对染料和重金属的吸附实质是菌体表面对染料和重金属的吸附,菌体表面是由细胞壁和细胞膜组成的,其中含有甘露聚糖、葡聚糖、磷壁酸、蛋白质和脂类等多种成分,菌体表面的这些成分所暴露出来的基团对生物吸附的功能有重要的作用,但具体机制目前仍不清楚。
因此,对菌体表面的性质进行表征对于其吸附机制的研究有重要意义。
目前对吸附剂表面特征的研究方法有红外、紫外、XPS和EXAFS等直接观测手段以及Zeta电位、酸碱滴定等分析方法,这些技术广泛地应用于无机矿物和氧化物的表征及吸附机理的研究,而在生物吸附领域则应用较少。
对生物表面的官能团等进行表征,所获得的有关生物表面的信息为推测生物表面吸附作用机理提供了重要的理论依据[3]。
本次研究应用酸碱滴定表面分析手段和Protofit软件对菌体表面进行分析,并用红外光谱进行验证,为菌体和吸附剂之间相互作用机理的研究提供依据。
该研究方法国内还未见报道。
而该实验的顺利开展弥补了国内在菌体表面基团表征方法方面的空白。
为微生物在环境污染中的应用奠定了坚实的基础。
Protofit软件简介:
它是一种酸碱滴定数据分析和优化表面质子化模式的工具并可以进行仿真滴定。
它可以用四种表面络合模型中的一种来对一到四种表面功能基团位点进行优化拟合,从而得出该位点的pKa和浓度。
这四种模型是:
表面离散模型(DLM)、固定电容模型(CCM)、donnan壳模型(DSM)、无静电吸附模型(non-electrostaticadsorption)(NEM)。
作为一种质子优化模型的工具,Protofit功能上类似于FITEQL(HerblinandWestall,1999,可以用来解决一个范围比较宽的优化问题)但是它操作更简单,功能更强大。
Protofit可以用于解决一定数量的酸碱滴定数据的模拟和分析,它具有以下优点:
(1)可以同时对一个和数个模型的平衡常数进行最优化;
(2)可以用来对表面络合模型进行模拟滴定;
(3)从数据和预测模型可以确定质子缓冲行为(可以用来比较预测模型和数据);
(4)可以计算体系中(吸附剂和溶剂)总的质子缓冲行为(包括观察值和预测模型);
(5)可以在对缓冲量的估计研究中计算出标准误差,并利用这个误差去衡量优化的好坏;
(6)可以追踪预测模型的表面电荷行为。
ProtoFit有两种运行模型:
一是模拟模型,二是优化模型。
模拟模型:
是对实际过程和预测模型的数据进行分析和比较;优化模型:
在实际过程和预测模型中找到一个最好最合适的模型参数。
本实验主要应用该软件对滴定数据进行处理,通过拟合和优化菌体表面基团的pKa和浓度[4,5]。
2材料与方法
2.1化学试剂
NaOH(AR)由天津市申泰化学试剂有限公司提供,NaCl(AR)、HCl(AR)、邻苯二甲酸氢钾(AR)、CH3CH2OH(AR)、四硼酸钠(AR)由成都市科龙化工试剂厂提供,KBr(光谱纯)由天津市丰越化学品有限公司提供。
2.2供试材料
面包酵母菌(Saccharomycescerevisiae):
哈尔滨玛利酵母有限公司购置。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis(Ehrenberg)):
四川农业大学生物化学与分子生物学实验室提供。
2.3仪器设备
表1实验仪器
Table1Experimentalapparatus
名称
规格型号
公司与产地
电子天平
BT124S
北京赛多利斯仪器系统有限公司
自动电位滴定仪
ZD-2型
上海大普仪器有限公司
超纯水设备
KL-UP-Ⅱ-20
台湾艾柯
离心机
80-2型
上海手术器械厂
红外光谱测定仪
FTIR-8400S
日本岛津
磁力加热搅拌器
78-1型
中外合资深圳天南海北有限公司
烘箱
DHG-9240型
青岛海尔股份有限公司
2.4实验方法
2.4.1供试材料前处理
面包酵母菌的处理:
将面包酵母用10倍体积的超纯水洗涤,5000r/min离心10min,去上清液。
重复三次得湿菌,置于烧杯中密封放入5℃冰箱中冷藏备用。
无水乙醇修饰面包酵母菌:
取10g备用面包酵母菌样于100mL无水乙醇中,室温下磁力搅拌30min,5000r/min离心10min,超纯水洗涤,离心,去上清液。
重复三次得湿菌,置于烧杯中密封放入5℃冰箱中冷藏备用[6]。
枯草芽孢杆菌的提取:
将在30℃下培养了72h的枯草芽孢杆菌发酵液5000r/min离心15min,去上清液。
超纯水洗涤,5000r/min离心,去上清液,重复三次得湿菌,置于烧杯中密封放入5℃冰箱中冷藏备用。
2.4.2酸碱滴定实验
2.4.1.1NaOH、HCl、NaCl标液的配制[7]
在此实验中,溶液的配制用水均为超纯水煮沸2h,充分去除水中的CO2,并冷却后密封(实验中如果未做特殊说明,超纯水均为此水)。
以下溶液均先配制1mol/L的标准溶液,再稀释成0.1mol/L的溶液备用。
1mol/LNaC1溶液的配制:
称取14.6450g优级纯的NaC1于250mL烧杯中,超纯水溶解并定容至250.0mL,备用。
1mol/LHCl的配制及标定:
用量筒量取21mL优级纯盐酸,倒入有一定量1mol/LNaC1溶液的烧杯中,同时用玻棒搅拌,1mol/LNaC1溶液定容至250.0mL,用自动电位滴定仪进行标定(用0.1mol/LNaC1溶液来配制盐酸,是因为在菌体的滴定过程中防止由于盐酸和NaOH的加入而导致NaC1的浓度发生变化,从而引起体系的离子强度的变化,从而影响pH的测定,NaOH的配制也相同)。
称取1.5g左右的硼砂三份用超纯水溶解,滴定终点定为5.0,通过标定得出盐酸的最终浓度为0.7954mol/L,标准误差<0.3%。
1mol/LNaOH的配制和标定:
称取14.2438gNaOH于250mL烧杯中,先加入少量1mol/LNaC1溶液清洗NaOH,去除NaOH表面的Na2CO3和NaHCO3。
溶解后,1mol/LNaC1溶液定容至250.0mL。
用自动电位滴定仪进行标定。
称取1.5g左右的邻苯二甲酸氢钾三份用超纯水溶解,滴定终点定为9.0,通过标定得出NaOH的最终浓度为0.8650mol/L,标准误差<0.3%。
2.4.1.2菌体的酸碱滴定[8-12,19,22-25]
称0.3−3g菌样(干重)于250mL的三颈瓶中,加入100mL,0.1mol/LNaC1电解质溶液,将混合溶液密封,并保持在N2的吹脱条件下,25℃,150r/min磁力搅拌1h。
然后逐滴加入0.1mol/LHCl,直至悬浮液pH为3.0,继续搅拌2h,直至pH稳定。
在磁力搅拌的同时,用0.1mol/LNaOH滴定至体系pH为10.0,滴定剂滴加模式为动态模式,每次0.05ml,且pH稳定并记录后再进行下一次滴定。
而空白样则在不加菌样,其它条件相同情况下滴定。
2.4.3数据处理
整理数据用Protofit进行处理。
首先要选定所测基团数目、每个基团的类型、表面配合模型;其次在优化界面输入每个基团的预测pKa以及对应的基团浓度;然后导入数据点击运行,选择一个加权平方和SS*值最小的结果进行拟合,得出最终结果。
2.4.4FTIR谱图分析
先以光谱纯KBr试剂200mg为空白,压片,用FTIR−8400S红外光谱仪进行测定,后面的样品将自动以此空白扣除背景。
再分别将干燥的面包酵母菌和枯草芽孢杆菌的原菌、质子化菌以及滴定后的菌样各5mg与光谱纯KBr试剂150mg混匀后,压片,上机进行测定。
3结果与讨论
本实验共测定了面包酵母菌和枯草芽孢杆菌两种菌体的表面基团,其中面包酵母菌测定了原菌和乙醇处理两个样。
实验结果如下:
3.1面包酵母菌的两种处理后的滴定结果和枯草芽孢杆菌的滴定结果
酸碱滴定是研究固体颗粒表面性质的一种重要实验方法,固体颗粒的表面电荷、表面电位以及表面酸碱特性都可以通过酸碱滴定的方法进行研究,利用酸碱滴定数据可以计算出表面电荷性质参数和表面酸度常数。
它是研究颗粒物吸附性质的重要基础[13]。
研究发现离子强度对滴定结果有影响:
离子强度在0.01mol/L~0.1mol/L之间,测得的基团浓度随离子强度增加而增加。
这可能是由于不同的离子强度,导致菌体表面的电场改变,对质子在菌体表面的吸附/解吸过程造成影响,使滴定结果出现偏差。
本实验选择混合液的离子强度为0.1mol/L,并在实验过程中保持该离子强度不发生改变[9,10,13]。
滴定过程中可以发现,在离子强度恒定为0.1mol/L的NaCl电解质溶液中,出现了滞后现象,这主要是由于菌体表面的功能基团的质子化与去质子化过程是可逆的。
而之所以把滴定的pH范围定在3.0~10.0,是因为pH过低(pH<3)或过高(pH>10)都可能造成细胞的破裂或溶解,从而使菌体内部的一些基团暴露干扰表面基团的测定。
但是由于限定了pH的范围使一些基团不能被滴定,从而不被检测[13]。
Origin分析酸碱滴定实验数据,如图1、2所示。
图1面包酵母菌原菌、乙醇修饰以及空白滴定
Figure1Theacid−basetitrationcurvesofdifferentbiomassandblank
图2枯草芽孢杆菌和空白滴定
Figure2Theacid−basetitrationcurvesofBacillussubtilis(Ehrenberg)andblank
在酸碱滴定过程中,体系消耗的OH-主要参与两类反应:
微生物的表面反应和调节溶液pH。
而在空白液的碱滴定中,消耗的OH-只参与调节溶液pH。
因此,到达相同pH,菌样消耗的NaOH的体积远大于空白滴定消耗的体积[8],说明菌体表面基团对溶液中质子的强烈的吸附作用。
而在用Protofit进行数据处理时不需要输入空白的碱用量,将自动扣除背景值。
图1中:
比较A和B,可以发现在pH=5.5处有一个交叉点,在pH<5.5时,A所用的NaOH的量较B的少,而在pH>5.5时,B所用的NaOH的量较A少。
因此可以推断在pH<5.5时,面包酵母菌原菌表面质子化基团的量比乙醇修饰过的酵母菌表面质子化基团多,而在pH>5.5时,乙醇修饰过的酵母菌表面质子化基团的量较包酵母菌原菌表面质子化基团的量多。
通过查阅资料得出各基团的pKa范围[14-17](表2)及通过Protofit软件对实验数据进行拟合分析得面包酵母菌和枯草芽孢杆菌表面基团的pKa和浓度(表3)如下:
表2pKa参考范围
Table2TheValueofpKareferred
基团
离解平衡式
pKa
羧基
R-COOH→R-COO-+H+
2~6
含磷基团
R-OPO3H2→R-OPO3H-+H+
R-OPO3H-→R-O-PO32-+H+
R-O-PO2H-O-R→R-O-PO2--O-R+H+
0.2~2.9
3.2~3.5
5.6~7.2
胺基
R-NH3+→R-NH2+H+
9.0~11.0
羟基
R-OH→R-O-+H+
8~12
本次实验主要是测定菌体表面的羧基、含磷基团、胺基、羟基的pKa及对应基团的浓度。
而分析菌体表面滴定数据需要先对菌体表面进行模型拟合,常用的模型有恒电容模型(CCM)和无静电吸附模型(NEM),CCM是主要用于矿石、活性炭等假设表面分布均匀,表面基团较为单一,表面基团吸附/解吸情况较为简单的模型,并不适用于菌体这种表面基团复杂的情况,因此本实验选择NEM模型[13]。
使用Protofit软件进行数据处理得出的拟合结果如下:
图3面包酵母菌的拟合结果
Figure3ThefittingresultofSaccharomycescerevisiae
图4面包酵母菌乙醇修饰的拟合结果
Figure4ThefittingresultofethanolmodifiedSaccharomycescerevisiae
图5枯草芽胞杆菌的拟合结果
Figure5ThefittingresultofBacillussubtilis(Ehrenberg)
由图3、4、5可以看出拟合结果与实验数据基本吻合(图中黑色线代表实验数据,蓝色线代表拟合曲线,两条线基本重和)。
通过不断的拟合,可以得到一个加权平方和SS*,此值越小越好[13]。
上述三种菌样的加权平方和SS*分别为7.994E-3、3.820E-3、1.879E-2。
拟合结果中位点1的(基团)pKa分别是4.430、3.650、4.240,由表2可知在羧基pKa范围内(2~6),确定位点1为羧基,浓度分别为0.457mol/Kg、0.562mol/Kg、0.631mol/Kg。
位点2的pKa分别为6.770、6.250、6.150,由表2可知在含磷基团pKa范围内(0.2~2.93.2~3.55.6~7.2),因此可推断位点2是含磷基团,其浓度分别为0.354mol/Kg、0.333mol/Kg、0.407mol/Kg。
位点3的pKa分别是9.890、9.000、9.000,由表2可知在胺基的范围内(9.0~11.0)。
因此可以推断位点3是胺基,其浓度分别是0.0251mol/Kg、0.263mol/Kg、0.676mol/Kg。
位点4的pKa分别为9.800、9.650、10.640,由表2可知在羟基的范围内(8~12),其浓度分别为0.851mol/Kg、0.166mol/Kg、1.950mol/Kg。
综合结果如下表:
表3实际测得pKa及相应基团浓度
Table3pKavaluestestedforbacteriaanddensitiesoftherelatedgroups
位点
基团
酵母菌基团pKa
酵母菌基团浓度(mol/Kg)
乙醇处理酵母菌基团pKa
乙醇处理酵母菌基团浓度(mol/Kg)
芽孢杆菌基团pKa
芽孢杆菌基团浓度(mol/Kg)
1
羧基
4.430
0.457
3.650
0.562
4.240
0.631
2
含磷基团
6.770
0.354
6.250
0.333
6.150
0.407
3
胺基
9.890
0.0251
9.000
0.263
9.000
0.676
4
羟基
9.800
0.851
9.650
0.166
10.640
1.950
比较面包酵母菌原菌与乙醇修饰后的面包酵母菌,后者相应基团的pKa都有所下降。
原因可能是由于C2H5OH的渗透作用使酵母菌内蛋白质变性,细胞壁破坏,导致部分细胞结构塌陷、破损,细胞的通透性增加(细胞虽然被破环,但是细胞的基本结构基本没变,并没有造成细胞内部的蛋白质等被释放,因此并不影响菌体表面基团的测定),基团周围的环境发生变化,如多孔状细胞壁中暴露有机官能团数量增多,基团之间的氢键等作用力造成pKa的下降。
上述pKa的下降的原因也是乙醇修饰后的面包酵母菌的羧基和胺基增加的原因。
但是含磷基团和羟基都减小,这主要是由于含磷基团和羟基是由菌体细胞壁中的肽聚糖提供,在用乙醇处理的过程中使菌体细胞壁中的肽聚糖被大量的水解,而细胞壁以及内部的细胞膜上的一些肽链或是蛋白质都被暴露出来,因此乙醇修饰后的面包酵母菌的羧基和胺基都有增加,含磷基团和羟基都减小。
比较面包酵母菌与枯草芽孢杆菌有两点不同:
一是相应基团的pKa都有所不同;二是后者的基团浓度高于前者,这可能是由于面包酵母菌单体(1~5×5~20μm)比枯草芽孢杆菌单体(0.7~0.8×2~3μm)大,而且枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙,而面包酵母菌表面光滑,造成枯草芽孢杆菌的比表面大于面包酵母菌,而两者的细胞壁的成分都是肽聚糖,因此枯草芽孢杆菌表面基团比面包酵母菌表面基团浓度更高。
3.2面包酵母菌原菌和醇处理菌以及枯草芽孢杆菌原菌的质子化前后及滴定后的红外测定结果
图6、图7、图8、图9分别为面包酵母菌原菌和乙醇处理菌以及枯草芽孢杆菌原菌质子化前化后及滴定后的红外图:
图6面包酵母菌原菌、乙醇修饰面包酵母菌、枯草芽孢杆菌的红外光谱
Figure6IRofSaccharomycescerevisiae,ethanolmodifiedSaccharomycescerevisiaeandBacillussubtilis(Ehrenberg)
图7面包酵母菌原菌质子化前后、滴定后的红外光谱
Figure7IRofSaccharomycescerevisiaebeforeandafterprotonation
图8面包酵母菌醇处理菌质子化前后、滴定后的红外光谱
Figure8IRofethanolmodifiedSaccharomycescerevisiaebeforeandafterprotonation
A三种样品的红外图整合在同一坐标系上
B三种样品的红外图叠加在同一坐标系上
图9枯草芽孢杆菌质子化前后、滴定后的红外光谱(A、B)
Figure9IRofBacillussubtilis(Ehrenberg)beforeandafterprotonation(A、B)
红外光谱在鉴定菌有机官能团及推断重金属吸附机理等方面有着重要作用。
图6中A、B、C分别为面包酵母原菌、C2H5OH修饰面包酵母、枯草芽孢杆菌的红外光谱图(由于有些峰较弱,在通过压缩基本看不到,但实际上在该波数是有吸收的)。
由图A看出面包酵母菌所含组分复杂,整个波数范围内均有吸收,一些不太灵敏的吸收峰被掩盖。
按文献对谱带进行归属[4,18],碳水化合物和蛋白质是面包酵母的主要成分。
其中3316.4cm-1宽带是缔合−NH/−OH伸缩振动吸收峰;1649.6和1532.5cm-1谱峰来自蛋白质酰胺Ⅰ带(C=O伸缩振动)和酰胺Ⅱ带(N−H弯曲与C−N伸缩振动叠加);1407.8cm-1处的吸收归属于羧基(CO−O)中的C−O伸缩和−OH弯曲引起的;由C−N伸缩和N−H弯曲振动耦合形成的酰胺Ⅲ带在1249.7cm-1处有吸收;1049.2cm-1主要为糖类C−OH以及P−O−C伸缩振动的贡献。
比较图6A、B发现,每个位置上的吸收峰都发生了位移,但都不大,并没有偏离相应基团的吸收峰范围,因此A、B中含有相同的基团。
乙醇修饰菌缔合−NH/−OH吸收强度有少许增加,并发生2.1cm-1的低波数位移。
另外,酰胺Ⅲ高波数位移至1251.3cm-1,乙醇修饰菌在1649.1cm-1、1534
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