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5微生物的培养与应用学生版
专题二微生物的培养与应用
[考点一] 培养基及微生物的纯化培养技术
一、培养基
1.概念:
人们按照微生物对_营养物质___的不同需求,配制出的供其_生长繁殖___的营养基质。
2.种类
(1)按物理状态可分为_液体培养基_____和_固体培养基__半固体培养基___。
(2)按功能可分为_选择培养__基和_鉴别培养基_____。
3.成分:
各种培养基一般都含有水、_碳源__、_氮源__和_无机盐_,此外还要满足微生物生长对_PH__、特殊营养物质以及_氧气__的要求。
[典型例题1]据某微生物培养基的配方表回答下列问题
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4g
4.0g
0.5g
0.5g
100mL
(1)此培养基按物理性质划分属于液体培养基,因为没有凝固剂(如琼脂);按功能划分属于选择培养基,因为没有碳源,只有自养型微生物才能生长(利用空气中的CO2)。
(2)此培养基含有的微生物的营养成分包括水、氮源和无机盐三类,若加入氨基酸,则它可充当的营养成分包括氮源、碳源和生长因子。
(3)若要观察微生物的菌落特征,培养基中应添加的成分是凝固剂。
(4)若用该培养基来分离尿素分解菌,应除去表中成分1(填表中序号),应加入尿素和不含氮元素的有机物。
二、无菌技术
1.关键:
_防止外来杂菌的入侵_
2.常用方法
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂
消毒法
用酒精擦拭双手,用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容器
3、无菌技术:
(1)实验前:
①对操作空间、操作人员清洁和消毒②对所用器皿、接种用具和培养基灭菌
(2)操作时:
①在酒精灯火焰附近无菌区操作②避免已灭菌处理材料再次
[思考1]无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么目的?
避免感染操作人员
三、大肠杆菌的纯化培养
1.制备固体培养基的步骤
→
→
→_灭菌__→_倒平板__
2、倒平板:
待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是:
①在火焰旁右手拿装有培养基的锥形瓶,左手拔出棉塞;
②使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰;
③左手将培养皿打开一条稍大于培养皿的缝隙,右手将锥形瓶中的培养基导入培养皿,立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后,将平板倒置。
[思考3]灭菌时,盛有培养基的锥形瓶和待倒入培养基的培养皿采用方法分别是哪种方法?
灼烧灭菌高压蒸汽灭菌
[思考4]倒平板时,要将锥形瓶迅速通过火焰,为什么?
防止杂菌污染
[思考5]将培养基倒入培养皿后,为什么把培养皿倒置?
避免皿盖上的水珠落入培养基造成污染
3.纯化大肠杆菌:
最常用的接种方法是_平板画线法__和_稀释涂布平板法____。
(1)原理:
在培养基上将细菌稀释或分散成 一个细胞 ,使其长成单个的菌落,这个菌落就是一个大肠杆菌的细菌菌落。
(2)方法a.平板划线法:
通过接种环在固体培养基表面 连续划线 的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
[思考6]
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
消灭接种环上的微生物
防止细菌污染环境
[思考7].灼烧接种环,为什么待其冷却后才能伸入菌液?
避免高温杀死菌种
为什么第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始?
划线后线条末端比线条起始处要少,能使细菌数目随划线数目增加而逐步减少,最终得到单个细菌繁殖而来的菌落。
为什么划线不能用力过大?
避免划破培养基
(2)稀释涂布平板法:
将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。
当稀释倍数足够高时,即可获得单个细菌形成的标准菌落。
系列稀释操作:
①取分别盛有9mL水的试管6支试管灭菌,编号101、102、103、104、105、106。
②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中,并吹吸3次使之混匀。
③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹吸均匀,获得102倍液。
依此类推。
【思考8】若某培养基上出现了3种特征不同的菌落是什么原因?
有杂菌污染
【思考9】频繁使用的菌种利用什么法保存?
长期保存菌种的方法是什么?
放入4℃的冰箱中冷藏甘油管藏
[典型例题2](2019全国I卷)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解,会造成环境污染。
某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基:
在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5g/L)。
Ⅱ号培养基:
氯化钠(5g/L),硝酸铵(3g/L),其他无机盐(适量),X(15g/L)。
Ⅲ号培养基:
氯化钠(5g/L),硝酸铵(3g/L),其他无机盐(适量)。
X(45g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中,为微生物提供氮源的是__牛肉膏、蛋白胨___。
Ⅱ、Ⅲ号培养基为微生物提供碳源的有机物是__X_______。
(2)若将土壤悬浮液种在Ⅱ号液体培养基中,培养一段时间后,不能降解X细菌比例会__下降___,其原因是_不能降解X的细菌因缺少碳源而不能繁殖,而降解X的细菌能够繁殖________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基,若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数,接种时,应采用的方法是_稀释涂布平板法______。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌,且该菌能将X代谢为丙酮酸,则在有氧条件下,丙酮酸可为该菌的生长提供__能量___和_合成其他物质的原料____。
[典型例题3].大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌,其代谢产物能与染料伊红美蓝反应,使菌落呈黑色。
如表是其培养基配方:
成分
蛋白胨
乳糖
磷酸二氢钾
琼脂
蒸馏水
2%伊红水溶液
0.5%美蓝水溶液
含量
10g
10g
2g
20~30g
1000mL
20mL
13mL
回答下列问题:
(1)该培养基中,蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有__碳源氮源__________和维生素。
从物理性质来看,该培养基属于____固体________培养基。
(2)对该培养基进行灭菌时,可采用___高压蒸汽灭菌法_________法。
在接种大肠杆菌前,需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间,观察是否有菌落生成,其目的是_____检验培养基是否完全灭菌___________________________。
(3)为检测严重污染水体中大肠杆菌数量,将水样适当稀释后,取样涂布在上述平板培养基中,应选择颜色为__黑色______的菌落进行计数。
该方法是通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数,其原理是_当样品的稀释度足够高是,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个菌落_______。
[典型例题4].(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中,对环境有严重危害。
小明同学准备依据如图操作步骤,从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。
请回答下列问题:
(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水,其中可作为碳源的有___蛋白胨、苯酚_________。
(2)将采集到的样品接种培养,苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_增加_______,以达到富集酚降解菌的目的。
若上图平板中菌落过于密集,应进一步__稀释涂布__________,以便于菌落计数与分离。
制备平板培养基时除了需要水、营养物质外,还必须添加___凝固剂_____。
(3)右图为连续划线法示意图,在图中___3____(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。
先制作系列浓度梯度并进行显色反应,下表中1~5号比色管的苯酚浓度应分别为__0、0.2/0.4/0.6/0.8______________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度(mg/L)
1
如果废水为50mg/L苯酚溶液,降解后约有21%的苯酚残留,则需将残留液稀释___3___(填序号:
①5 ②10 ③20)倍后,再进行比色。
考点二 微生物的筛选与计数
一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.筛选菌株的原理:
人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.统计菌落数目的方法:
活菌计数法法和显微镜直接计数法法。
3.实验流程
―→样品稀释―→
―→
―→
4.尿素分解菌的鉴定
(1)原理:
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为
,使培养基的碱性升高。
(2)实验流程
土壤取样(富含有机质)→配制土壤溶液和制备 培养基 → 梯度稀释 →涂布平板与培养→细菌的 计数 。
(3)鉴定
①原理:
细菌分解尿素的反应中,细菌合成脲酶将尿素分解成了 无机物 ,
其会使培养基中的 碱性 增强,pH升高。
②方法:
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂培养分解
尿素的细菌,如果pH升高,指示剂将变红。
[归纳拓展]两种微生物计数方法的比较
间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个细胞,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血球计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数=
×M
C:
某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:
涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:
稀释倍数
每毫升原液所含细菌数:
每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏低
比实际值偏高
【思考10】为什么分离不同微生物要采用不同的稀释度。
细菌的体积不同
【思考11】选择平板进行计数时,以平板上的菌落数多少为原则?
在这一稀释度下,至少几个平板的菌落数相近才可以?
30到3002个
【思考12】计数时,为什么每隔24小时统计一次菌落数目,且选取菌落时稳定时记录作为结果?
防止因培养时间不足而遗漏菌落数目
二、分解纤维素的微生物的分离
1.纤维素酶
(1)组成:
纤维素酶是一种复合,至少包括三种组分,即C1酶、Cx酶和
葡萄糖苷酶酶。
(2)作用:
2.纤维素分解菌的筛选
(1)原理:
红色复合物
红色消失,出现透明圈。
(2)方法:
刚果红染色法
刚果红倒平板
3.实验流程
纤维素纤维素梯度稀释鉴别纤维素分解菌透明圈
[归纳拓展]微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状大小隆起程度颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂,培养某种微生物后,培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法,根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物
【思考13】在纤维素微生物的分离流程中,选择培养用的培养基有什么特点?
其目的是什么?
液体分离出纤维素分解菌
[典例分析]5.(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块,加水煮沸一定时间,过滤得到马铃薯浸出液。
在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂,用水定容后灭菌,得到M培养基。
回答下列问题:
(1)M培养基若用于真菌的筛选,则培养基中应加入链霉素以抑制__细菌______的生长,加入了链霉素的培养基属于__选择______培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质,营养物质类型除氮源外还有___碳源无机盐_______________(答出两点即可)。
氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有___蛋白质核酸_____________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖,接种土壤滤液并培养,平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。
加入的显色剂是_碘液_______,该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是______淀粉遇淀变蓝,产生淀粉酶的菌落周围淀粉被水解,产生透明圈_________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量,在同一稀释倍数下得到以下结果:
甲同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149,取平均值133;
乙同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是27、169和176,取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中,乙同学的结果可信度低,其原因是_________乙的结果中一个数据与其余两个数据相差较大________。
6.在白酒发酵的窖池中,当培养液的pH≤4.5时,酵母菌的代谢活动逐渐受到抑制,甚至停止。
耐酸性酵母菌能在pH≤3.5的环境下继续表现出较强发酵能力,适宜作白酒发酵生产用菌种,为选育适合白酒生产的耐酸性强的酵母菌,研究者进行了相关实验,请回答下列有关问题:
(1)在发酵过程中,窖池中培养液的pH会逐渐下降,原因是
_____细胞呼吸生成二氧化碳______________________。
(2)通过如图所示__稀释涂布平板法______________法进行菌种纯化培养,取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布,要将涂布器____灼烧冷却____________后才能进行操作。
在恒温培养箱中培养一段时间后,其中某组的3个平板上菌落数分别为99个、92个、94个,则可以推测酵母菌液中每毫升含菌数为__9.5*10八次方______个。
运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小,原因是____当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落_______________。
(3)实验获得了三个耐酸性较强的酵母菌菌株,特点如表。
菌株
A
B
C
特点
pH≤3.5时,生长代谢正常、优于其他常规菌种
pH≤3.5时,生长代谢正常,pH为4~6时不正常
pH为2.5~6时,生长代谢正常、优于其他常规菌种
依据菌株特点,研究者认为___C_____菌株更适合作为白酒发酵菌株,做出这一判断的理由是___PH的耐受范围更大,能抑制正常发育繁殖____________。
[归纳拓展]常用的选择培养基与鉴别培养基
类型
实例
选择培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
以纤维素作为唯一碳源的培养基用于分离纤维素分解菌
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
石油是唯一碳源时,可以抑制不能利用石油的微生物的生长,使能够利用石油的微生物生存,达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物
鉴别培养基
加入伊红美蓝可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)
加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌
加入刚果红可以鉴别纤维素分解菌
[课后巩固案]
1.关于实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作,下列说法正确的是( A )
A.配培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B.倒平板时,倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C.划线接种时,灼烧接种环后立即进行再次划线
D.划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱中培养
2.下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述,错误的是( B )
A.常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B.平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C.稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D.用血细胞计数板计数微生物时,实验结果往往比稀释涂布平板法得到的结果偏大
3.以下关于分离纤维素分解菌的实验操作错误的是( A )
A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B.选择培养这一步可省略,但得到的纤维素分解菌会较少
C.可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量
D.对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到含纤维素的培养基上
4.下表表示某培养基的配方,下列叙述正确的是( D )
成分
蛋白胨
葡萄糖
KH2PO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10g
10g
2g
0.4g
0.065g
1000mL
A.从物理性质看该培养基属于液体培养基,从用途看该培养基属于选择培养基
B.培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖,属于氮源的物质是蛋白胨
C.该培养基缺少提供生长因子的物质
D.该培养基调节合适的pH后就可以接种
5.如图是微生物平板划线示意图,划线的顺序为1→2→3→4→5,下列说法正确的是( D )
A.操作前要将接种环用酒精消毒
B.划线操作须在酒精灯火焰上方进行
C.只有在5区才可以得到所需菌落
D.在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌
6.取9个洁净培养皿,均分为三组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),各组分别加入等量的不同培养基,每个平板均用涂布法接种0.1mL大肠杆菌菌液,37℃培养36h后,统计菌落数(见表),以下相关叙述正确的是( A )
组别
培养基
各平板的菌落数
1
2
3
Ⅰ
琼脂、C6H12O6、NH4NO3
30
31
27
Ⅱ
琼脂、C6H12O6、NH4NO3、维生素
169
178
193
Ⅲ
琼脂、NH4NO3、维生素
0
0
1
A.Ⅰ组和Ⅱ组说明维生素可以促进大肠杆菌生长
B.Ⅰ组和Ⅲ组说明大肠杆菌正常生长需要糖类物质
C.三组实验均使用了液体培养基,以方便菌落计数
D.三组实验所使用的培养基均需62℃、30min消毒
二、高考题型练
7.据某微生物培养基的配方表回答下列问题
成分
纤维素粉
NaNO3
Na2HPO4·7H2O
KH2PO4
含量
5g
1g
1.2g
0.9g
成分
MgSO4·7H2O
KCl
酵母膏
水解酪素
含量
0.5g
0.5g
0.5g
0.5g
将上述成分溶解后,用蒸馏水定容到1000mL
(1)该培养基对微生物是否具有选择作用?
如果具有,又是如何进行选择的?
有,只有能分解纤维素的细菌可以生长繁殖
(2)你能否设计一个对照实验,说明选择培养的作用?
牛肉膏蛋白胨
(3)如果用该培养基来鉴别纤维素分解菌,需要加入的成分有哪些?
牛肉膏蛋白胨
8、(2019·济南一模)环境污染物多聚联苯难以降解,受到多聚联苯污染的土壤中,常有重金属污染同时存在。
研究发现联苯降解菌内的联苯水解酶是催化多聚联苯降解的关键酶。
为了从富含多聚联苯的环境中分离联苯降解菌,某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见表):
维生素
NH4NO3
MgCl2
多聚联苯
水
琼脂
培养基甲
+
+
+
+
+
+
培养基乙
+
+
+
+
+
-
注:
+表示添加该物质,-表示没有添加该物质
(1)甲培养基中加入多聚联苯作为__碳源______用于培养联苯降解菌,该培养基属于_选择_______(填“选择”或“鉴别”)培养基。
接种前需对甲培养基采用__高压蒸汽灭菌______________法进行灭菌。
(2)培养基乙_能_______(填“能”或“不能”)用于测定联苯降解菌的数量,原因是___可以采用显微镜计数法测量联苯降解菌数量_______。
统计联苯降解菌数量时,应进行多组实验,再__取平均值______。
(3)联苯降解菌在实验室里的降解率很高,但是实际污染环境的治理中降解率很低,这可能是因为___环境不同_____________________________(答出一种可能即可)。
9.(2018·江苏高考)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半,可作为饲料蛋白的来源。
有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养,这样既可减少污染又可降低生产成本。
研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母,并进行大量培养。
下图所示为操作流程,请回答下列问题:
(1)配制培养基时,按照培养基配方准确称量各组分,将其溶解、定容后,调节培养基的___PH_____,及时对培养基进行分装,并进行___高压蒸汽_________灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中,在步骤③中将温度约___50____(在25℃、50℃或80℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀,冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落,按步骤④所示进行划线。
下列叙述合理的有__abd______。
a.为保证无菌操作,接种针、接种环使用前都必须灭菌
b.划线时应避免划破培养基表面,以免不能形成正常菌落
c.挑取菌落时,应挑取多个菌落,分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度,获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中,为使酵母数量迅速增加,培养过程中需保证充足的营养和___氧气______供应。
(5)
,将发酵液稀释1000倍后,经等体积台盼蓝染液染色,用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数,理论上无 色细胞的个数应不少于 30 ,才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
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