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细胞生物学14章课件
细胞生物学(2010年秋季课程)
主讲:
王晓娟
学习本课程目的和任务
了解和掌握细胞的结构、功能、生活史以及各种生命活动的本质和规律.
学会从细胞的整体水平、亚细胞水平和分子水平三个方面来分析有关生命现象,能够以动态的观点考察细胞和细胞器的结构与功能.
以此进一步了解细胞的基本生命活动规律,以实现对其进行控制和利用.
学习的基本要求
能够运用分析与综合的方法将细胞结构与功能的关系进行阐述,为后序相关专业基础课的学习奠定基础.
第一章绪论
第一节细胞生物学发展简史
一、细胞的发现
●1604年
荷兰眼镜商詹森发明第一台显微镜.
●1665年
●英国的物理学家罗伯特虎克发现植物细胞,称为“cella”(是死的细胞壁).
●1674年
●荷兰布商列文虎克为了检查布的质量,亲自磨制透镜,装配了高倍显微镜(300倍左右),并观察到了血细胞、池塘水滴中的原生动物、人类和哺乳类动物的精子,这是人类第一次观察到完整的活细胞.
二、细胞学说的建立及其意义
●1838年
德国植物学家施来登提出:
尽管植物的不同组织在结构上有着很大的差异,但是植物是由细胞构成的,植物的胚是由单个细胞产生的.
●1839年
德国动物学家施旺提出了细胞学说的两条最重要的基本原理:
1)地球上的生物都是由细胞构成的;2)所有的生活细胞在结构上都是类似的.
●1855年
德国医生和病理学家魏尔肖补充了细胞学说的第三条原理:
所有的细胞都是来自于已有细胞的分裂,即细胞来自于细胞.
一切植物、动物都是由细胞组成的,细胞是一切动植物的基本单位.
细胞学说
细胞学说的重要补充
新细胞在老细胞的核中产生,由非细胞物质产生新细胞,并通过老细胞崩解而完成(一切细胞来自细胞).
细胞学说的主要内容
地球上所有生物都是由细胞构成的
细胞是生物形态结构和功能活动的基本单位
所有的生活细胞在结构上都是类似的
细胞来自于细胞
细胞学说的意义
细胞学说的创立大大推进了人类对生命自然界的认识,论证了生物界的统一性和共同起源,有力地促进了生命科学的进步.
恩格斯对细胞学说给予极高的评价,把它与进化论和能量守恒定律并列为19世纪的三大发明.
三、细胞学的经典时期
原生质理论的提出
●1840年普金耶(Pukinje)在动物中、1846年冯∙莫耳(vonMohl)在植物中分别看到了“肉样质”的物质,并将其命名为“原生质”(protoplasm).
●原生质理论
⏹有机体的组织单位是一小团原生质,种物质在一般有机体中是相似的.
细胞分裂的研究
雷马克(Remak,1841)在观察鸡胚血细胞时发现了细胞的直接分裂
费勒明(Flemming)在动物,施特拉斯布格(Strasburger)在植物中发现间接分裂.
1875年赫特维希(O·Hertwig)发现受精后卵中两亲本核的合并;1877年施特拉斯布格(Strasburger)在植物中也发现同样现象.
1898年纳互兴(Nawaschin)和1899年吉格纳特(Guignard)先后发现被子植物的“双受精作用”.
1883年范.贝内登(Vanbeneden)和1886年施特拉斯布格(Strasburger)分别在动物和植物中发现减数分裂现象.
重要细胞器的发现
电子显微镜的发明和应用把细胞学带入新的发展时期,观察到各种细胞器:
中心体
范.贝内登(Vanbeneden)
博费里(Boveri)
染色体
1888年沃尔德耶(Waldyer)
线粒体
1894年阿尔特曼(Altmann)
1897年本达(Banda)
高尔基体
1898年高尔基(Golgi)
四、实验细胞学时期
细胞学与实验胚胎学阶段(1887-1900)
赫特维希兄弟(O.和H.Hertwig,1887)等以海胆、蛔虫的卵作为材料,研究它们在外界条件影响下,刚受精的卵,雌雄原核是否能合并,去掉细胞核以后的卵是否能继续发育?
也有人用物理或化学的方法刺激没有受精的卵也能使之发育成为人工的孤雌生殖.
细胞遗传学阶段(1900-1926)
1902-1903年博韦里(T.Boveri)和萨顿(W.S.Sutton)提出了“染色体遗传理论”.
1910年摩尔根以果蝇为材料,研究它的遗传和变异,为细胞遗传学的发展奠定了基础.
细胞生理学的研究
1909年Harrison和Carrel创立了组织培养技术,为研究细胞生理学开辟了一条重要途径.
本斯莱等(Bensley和Hoerr,1934)和克劳德(Claude,1943)用快速离心机将细胞内的线粒体分离出来后,对这些细胞器的作用和化学组成的研究才有很大的进展.
细胞生理学的主要内容
研究细胞对周围环境的反应
细胞生长与繁殖的机制
细胞从环境中摄取营养的能力
机体代谢功能与其复制方法,
细胞的兴奋性、收缩性、分泌和细胞活动的其他表现机制
生物膜的主动运输和能量传递与生物电等.
细胞化学
1924年孚尔根等(Feulgen和Rossenbeck)首创了孚尔根核染色反应,以后就专门用来测定脱氧核糖核酸(DNA).
1940年布勒歇(Brachet,1940)用昂纳(Unna)染色液来测定细胞中的核糖核酸(RNA).
卡斯柏尔森(Caspersson,1936,1940)用紫外显微分光光度法测定DNA在细胞中的含量.
显微分光光度计
流式分光光度检测技术
放射自显影
分子定位杂交
免疫荧光
免疫胶体金
激光共焦点扫描显微镜技术
五、分子细胞生物学时期(1953-现在)
电镜时代的细胞学
上世纪60年代,随着电镜技术和固定技术的改进,显示出细胞质基质中微管、微丝和中等纤维的存在.
上世纪70年代,使用高压电镜技术,显示出细胞的立体结构微梁系统,认识到“细胞骨架”.
分子生物学的兴起
v分子生物学的新成就、新概念、新技术渗入细胞学各个领域
v一个基因一个酶(1941)转化作用的证明(1944)
vDNA含量恒定理论(1948)DNA双螺旋模型(1953)
vDNA聚合酶的发现(1956)半保留复制(1958)
v中心法则(1958)氨基酸密码的确定(1961)
v操纵子学说(1961)
细胞生物学
v从分子水平、亚细胞水平、细胞整体水平来研究细胞的各种生命活动,如生长、发育、遗传、变异、代谢、免疫、起源与进化.
六、细胞生物学学科的形成与发展
v细胞生物学是生物学的一个分支学科,与生物学许多其它分支学科相联系,并是这些学科的基础.
v细胞生物学是生命科学研究的基础,属于现代生物学教育的中心.
v生物科学的许多基本问题必须在细胞中谋求解决.
v细胞生物学的基础学科
v细胞生物学的分支
细胞生物学的基础学科
v物理学
v化学
v生物化学
v生物物理学
v生物数学
v……
以细胞生物学为基础的学科
●植物学
●动物学
●形态学
●解剖学
●分类学
●生理学
●组织学
●胚胎学
●遗传学
●免疫学
●分子生物学
●……
细胞生物学的分支
v细胞形态学
v细胞生理学
v细胞遗传学
v细胞化学
v分子细胞学
v细胞生态学
v细胞病理学
v细胞能力学
v细胞动力学
v……
第二节研究内容与现状
主要研究内容
细胞核、染色体以及基因表达的研究
●研究染色体结构动态变化与基因表达及其调控的关系,它是目前细胞生物学、遗传学与发育生物学在细胞水平与分子水平相结合的最活跃的热门课题.
生物膜与细胞器的研究
●生物膜的研究主要是膜的结构模型与物质的跨膜运输机制.
细胞骨架体系的研究
●细胞骨架在维持细胞形态与保持细胞内部结构的合理布局中起主要作用.
●细胞骨架与细胞内大分子的运输、细胞信息的传递、基因表达等密切相关.
细胞增殖及其调控
●从环境中与有机体中寻找控制细胞增殖的因子,以及阐明它们的作用机制.
●寻找控制细胞增殖的关键性基因,并通过调节基因产物来控制细胞的增殖.
●细胞的癌基因与抑癌基因及其表达产物均与细胞增殖有关.
细胞分化及其调控
●细胞分化的研究已经越来越显示出其重要性,也是细胞生物学、发育生物学与遗传学的重要汇合点.
●多数细胞生物学家认为肿瘤是不分化与去分化的结果,人们在考虑通过启动分化基因的表达来抑制癌基因的表达.
细胞的衰老与凋亡
●人们力图寻找细胞中的“衰老基因”及其信号转导.
●细胞凋亡是近年来生命科学中发展起来的重要的新兴领域之一.
细胞的起源与进化
●分子生物学方法引入生物进化的研究,为细胞进化和细胞器进化的研究增添了新的内容.
细胞工程
三大基本问题
细胞内的基因组是如何在时间与空间上有序表达的?
基因表达的产物-主要是结构蛋白与核酸、脂质、多糖及其复合物,它们如何逐级装配成能行使生命活动的基本结构体系及各种细胞器?
基因表达的产物-主要是大量活性因子与信号分子,它们如何调节细胞最重要的生命活动过程的?
当前主要趋势与重点领域
染色体DNA与蛋白质相互作用关系--主要是非组蛋白对基因组的作用
细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控
细胞信号转导的研究
细胞结构体系的组装
第二章细胞基本知识概要
第一节细胞的基本概念
一、细胞的化学组成
1.1细胞的元素组成
Ø水:
约占细胞总质量的70-90%,是一切生命活动的基质(溶剂)
Ø大量元素:
碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等
Ø微量元素:
锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等
Ø不同生物的细胞,其元素组成不同
Ø同种生物的不同生长期,元素组成不同
Ø元素含量有时能够反映生物生活的生境特征
1.2细胞的物质组成
Ø无机物质:
小分子的无机物质和无机离子,包括水、无机盐、各种离子等
Ø有机物质:
多糖、脂类、核酸、蛋白质、维生素等
二、组成细胞的主要器官与结构
2.1细胞壁
Ø真核生物的细胞壁主要由纤维素和几丁质构成,另外还含有少量的其它填充物质。
如小分子的糖、蛋白质和脂类。
Ø真菌(包括酵母菌、丝状真菌等):
主要成分是多糖类物质,如葡聚糖。
Ø藻类:
由纤维素构成。
2.2细胞质膜
Ø均为双层磷脂,蛋白质镶嵌其间。
但含有固醇类物质以增加韧性。
Ø质膜对营养物质的吸收方式有胞吞和胞饮作用
Ø具有细胞识别受体的糖脂类物质
2.3细胞质(cytoplasm)
Ø位于细胞膜和细胞核之间,包括:
细胞基质、细胞骨架和细胞器三部分。
2.3.1细胞基质
Ø细胞基质:
溶胶部分(液体部分),内含蛋白质(主要是酶)、代谢产物、内含物等,是细胞代谢活动的基地。
2.3.2细胞骨架
Ø细胞骨架:
由维管、肌动蛋白丝和中间丝构成的支架。
是细胞维持正常形态的主要支持物。
此外,还有运输功能。
2.3.3内质网(endoplasmicreticulum)
Ø内质网指细胞中由脂质双分子构成的一个与细胞基质相隔离、但彼此相连的囊腔和维管系统
Ø合成和运输蛋白质、脂类代谢产物和钙代谢产物等。
2.3.4核糖体(ribosomes)
Ø存在于各类细胞中的无膜包裹的颗粒状细胞器。
Ø主要功能是合成蛋白质
2.3.5叶绿体(chloroplast)
Ø绿色藻类及高等植物体内存在的一类能把光能转化为化学能的绿色颗粒状细胞器。
Ø合成光合产物。
2.3.6线粒体(mitochondria)
Ø是生物体内进行氧化磷酸化反应的重要细胞器
Ø将有机物氧化分解,提供能量。
2.3.7高尔基体(Golgibody)
Ø是细胞内大分子运输的一个枢纽,对大分子物质进行组装、修饰和运输。
2.3.8微体、溶酶体和液泡
Ø微体是一种单层膜包裹的细胞器,内含生化反应的酶类蛋白。
Ø溶酶体是内含消化酶类蛋白的细胞器。
Ø液泡:
生物体调节水份平衡的一类细胞器
2.4细胞核(nucleus)
Ø细胞核是细胞内遗传信息(DNA)储存、复制和转录的主要场所。
包括核膜、染色质和核仁等。
2.5鞭毛和纤毛(cilia)
Ø真核生物具有鞭毛或纤毛,是由蛋白质组成的维管构成,为“9+2”形式。
三、细胞是生命活动的基本单位
3.1一切有机体都是由细胞构成,细胞是构成有机体的基本单位.
3.2细胞具有独立的、有序的自控代谢体系,细胞是代谢与功能的基本单位.
3.3细胞是有机体生长与发育的基本单位.
3.4细胞是遗传的基本单位,细胞具有遗传的全能性.
3.5没有细胞就没有完整的生命.
四、细胞的其它基本知识概要
4.1细胞的基本结构体系
●生物膜系统
●生物膜系统构建了各种独立的细胞器
●生物膜的厚度均在8-10nm范围
●生物膜是控制物质运输、合成、装配、修饰等功能的场所
●生物膜系统将细胞内环境分成不同的区域,分别执行不同的功能
●遗传信息表达结构系统
●DNA-RNA-Pr组成的信息表达系统构成生命活动的基础
●细胞骨架系统
●由一系列特异的蛋白质装配形成的网架系统,与维持细胞形态、分裂、物质运输等密切相关
4.2细胞的大小及其规律
●细胞体积的守恒定律
4.3细胞形态与功能的协调性
Ø长期的进化,使不同的细胞适应于其功能的需求
五、原核细胞与真核细胞的比较
第三章细胞生物学研究方法
一、光学显微镜技术
1.1光学显微镜的演变历程
光学显微镜从其诞生之日起至今:
结构由简陋向精致发展
种类由单一向多样化、专业化转变
应用领域日趋广泛
1.2光学显微镜的组成
光学放大系统
–目镜
–物镜
照明系统
–光源
–折光镜
–聚光镜
机械和支架系统
光学显微镜的性能参数
分辨率:
区分开两个质点间的最小距离
放大倍数:
人眼的分辩力/显微镜的分辩力
荧光显微镜技术
●Fluorescencemicroscopy
●光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具
–免疫荧光技术
–荧光素直接标记技术
激光共焦点扫描显微镜技术
ØLaserscanningconfocalmicroscopy(LCSM)
Ø在研究亚细胞结构和组分等方面的应用越来越广泛
–共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点,即它们互相共焦点
LCSM的工作原理
Ø系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内
Ø调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像。
Ø这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
相差显微镜技术
ØPhase-contrastmicroscope(PCM)
–相差显微镜的样品不需染色,可以观察活细胞,甚至研究细胞核、线粒体等的动态。
–P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖
相差显微镜的原理
Ø把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。
–光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。
Ø环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
Ø相位板(annularphaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
微分干涉显微镜技术
ØDifferentialinterferencecontrastmicroscope(DIC显微镜)
–又称Nomarski相差显微镜(Nomarkicontrastmicroscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。
–与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。
–适于研究活细胞中较大的细胞器
Ø四个特殊的光学组件
–偏振器(polarizer)
●装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。
–DIC棱镜
●石英Wollaston棱镜。
可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。
聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。
最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。
–DIC滑行器
●石英Wollaston棱镜。
它把两束光波合并成一束。
这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。
●
–检偏器(analyzer)
●在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。
检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉
●x和y波的光程差决定着透光的多少。
光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。
于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。
ØDIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。
Ø目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。
倒置显微镜
Ø组成和普通显微镜一样,只是物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上,用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。
Ø
1.3当代显微镜的发展趋势
Ø采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。
Ø自动化与电子化
二、电子显微镜
Ø电子显微镜的高分辩率
–电子束光源,波长一般小于0.1nm
–分辨率可达0.2nm
Ø有效放大倍数
–0.2mm/0.2nm=106
Ø分辨本领
–电镜处于最佳状态下的分辨率
电子显微镜的基本构造
●电子束照明系统
–电子枪
–聚光镜
●成像系统
–物镜
–中间镜
–投影镜
●真空系统
●记录系统
主要电镜制样技术介绍
Ø超薄切片(ultrathinsection)技术
–固定
●锇酸(OsO4)和戊二醛
–包埋
●环氧树脂
–切片
●切片厚度20-50nm
–染色
●重金属盐染色
Ø负染色(negativestaining)技术
Ø用重金属盐(如磷钨酸、醋酸双氧铀)对铺展在载网上的样品进行染色;吸去染料,样品干燥后,样品凹陷处铺了一薄层重金属盐,而凸的出地方则没有染料沉积,从而出现负染效果。
Ø冷冻断裂或冷冻蚀刻(freezeetching)技术
Ø蚀刻(etching)是标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中,进行冰冻。
然后用冷刀骤然将标本断开,升温后,冰在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构,称为蚀刻。
Ø蚀刻后,向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角喷涂一层碳,加强反差和强度。
Ø然后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂的膜剥下来,此膜即为复膜(replica)。
复膜显示出了标本蚀刻面的形态,在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
Ø扫描电镜(scanningelectronmicroscope,SME)
扫描电镜的工作原理
ØScanningElectronMicroscope
Ø用一束极细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子。
Ø次级电子的多少与电子束入射角有关,也就是说与样品的表面结构有关。
Ø次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号。
Ø经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步的扫描图像。
Ø图像为立体形象,反映了标本的表面结构。
Ø为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
SEM的分辨率和放大倍数
Ø分辨力为6~10nm
Ø人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点
Ø则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X
扫描隧道电子显微镜
●Scanningtunnelingmicroscope,STM
●具有原子尺度的高分辨率
–测分辨率为0.1-0.2nm
–纵分辨率可达0.001nm
●可以在真空、大气、液体(接近于生理环境的离子强度)等多种条件下工作
●非破坏性测量
●应用STM直接观察到DNA,RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等的结构
扫描隧道电子显微镜的工作原理
●利用量子理论中的隧道效应
–将原子线度的极细探针和被研究物质的表面作为两个电极,当样品与针尖的距离非常接近时(通常小于1nm),在外加电场的作用下,电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极。
这种现象即是隧道效应。
扫描隧道电子显微镜的优点
ØSTM对样品表面进行无损探测,避免了使样品发生变化,也无需使样品受破坏性的高能辐射作用。
ØSTM能够轻而易举地克服“光的衍射现象”造成的限制,可获得原子级的高分辨率。
–任何借助透镜来对光或其它辐射进行聚焦的显微镜都不可避免的受到一条根本限制:
光的衍射现象。
由于光的衍射,尺寸小于光波长一半的细节在显微镜下将变得模糊。
STM与EM、FIM的各项性能指标比较
三、细胞组分的分析方法
3.1用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
1)差速离心
ØDifferentialcentrifugation
Ø在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。
Ø细胞器沉降的顺序:
核、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体、核糖体
沉降系数的概念
Ø沉降系数(s)是测量某一种物质在离心力作用时的沉降速度。
以漂浮单位S来表示。
每一个漂浮单位为1×10-13秒沉降系数,如果某一个蛋白质的沉降系数(s)为1×10-11秒,则为100个漂浮单位,即100S。
Ø沉降系数不是简单的相加,而是由颗粒的形状来决定的。
因为在离心机里旋转时,形状影响了沉降的速度。
2)密度梯度离心
Ø用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力的作用使细胞分层、分离的技术
密度梯度的配置
Ø介质特性的要求:
–能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高
–pH中性或易调整为中性
–浓度大时渗透压不大
–对细胞无毒
Ø常用的介质为氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖
密度梯度离心的分类
a)速度沉降
Øvelocitysedimentation
–主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。
–采用的介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
b)等密度沉降平衡
Øisopycnicsedimentation
–细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离。
–适用于分离密度不等的颗粒。
–介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度,而且介质的梯度要求较高的陡度,不能太平缓。
3.2细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质的显示方法
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