体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞中HPA和metastin的表达及米非司酮对其表达的影响和意义.docx
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体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞中HPA和metastin的表达及米非司酮对其表达的影响和意义
分类号:
R711.71单位代码:
10114
密级:
学号:
2008814
体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞中HPA和metastin的表达及米非司酮对其表达的影响和意义
研究生:
刘海瑛
指导教师:
李莉教授
申请学位门类级别:
医学硕士
专业名称:
妇产科学
研究方向:
妇科肿瘤
所在学院:
山西医科大学第一临床医学院
2010年3月20日
学位论文独创性声明
本人声明,所呈交的学位论文系在导师李莉教授指导下本人独立完成的研究成果。
文中任何引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。
论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
本文如违反上述声明,愿意承担以下责任和后果:
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论文作者签名:
日期:
年月日
学位论文版权使用授权书
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本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,署名单位仍然为山西医科大学。
(保密论文在解密后应遵守此规定)
论文作者签名:
日期:
年月日
指导教师签名:
日期:
年月日
(本声明的版权归山西医科大学所有,未经许可,任何单位及任何个人不得擅自使用)
目录
中英文对照表………………………………………………………………………………1
中文摘要…………………………………………………………………………2
英文摘要…………………………………………………………………………3
论文…………………………………………………………………………5
前言…………………………………………………………………………5
材料与方法………………………………………………………………………7
实验结果…………………………………………………………………………11
讨论…………………………………………………………………………14
结论………………………………………………………………………17
参考文献………………………………………………………………………18
附图……………………………………………………………………………20
综述……………………………………………………………………………21
正文…………………………………………………………………………21
参考文献…………………………………………………………………………30
个人简介…………………………………………………………………………33
致谢…………………………………………………………………………34
中英文缩略词表
英文缩写
英文全称
中文译文
AM
Adenomyosis
子宫腺肌病
Hpa
Heparanase
乙酰肝素酶
HSPG
HeparanSulfateProteoglyc
硫酸乙酰肝素蛋白多糖
TGF-β
Transforminggrowthfactorβ
转移生长因子β
IL-1
Interleukin-1
白细胞介素-1
MMP-9
MatrixMetalloproteinases-9
基质金属蛋白酶-9
ECM
ExtracellularMatrix
细胞外基质
BM
BasementMembrane
细胞基底膜
SDS-PAGE
sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS
phosphatebufferedsolution
磷酸盐缓冲溶液
EGF
EpidermicGrowthFactor
表皮生长因子
ER
EstrogenReceptor
雌激素受体
PR
ProgesteroneReceptor
孕激素受体
VEGF
VascularEndothelialGrowthFactor
血管内皮生长因子
FGF
FibroblastGrowthFactor
成纤维细胞生长因子
PDGF
Platelet-DerivedGrowthFactor
血小板源性生长因子
DMEM
Dullbecco’smodifiedEagle’smedium
达氏改良依氏培养基
PLC
phospholipasec
磷脂酶c
Western-blot
Western-blot
蛋白质转移印迹法
体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞中HPA和metastin的表达及米非司酮对其表达的影响和意义
摘要
研究背景子宫腺肌病(AdenomyosisAM)即子宫内膜侵入肌层达一个高倍视野以上,病理诊断子宫内膜基底层下≥3mm处出现子宫内膜腺体和间质[1]。
其病因和发病机理不清,可能与机械因素[2]、内分泌因素[3]、细胞凋亡因素[4]、免疫因素[5]等有关。
随着研究的进展,多学者认为子宫腺肌病的发生与子宫内膜的腺体和基质具有侵袭性有关[6]。
乙酰肝素酶(Heparanase,Hpa)作为一种葡萄糖醛酸酯酶,通过裂解乙酰硫酸肝素盐蛋白聚糖,释放和激活血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF),促进细胞的生长及转移,同时介导细胞粘附,在细胞外基质细胞的接触、生长和分化过程中起重要作用,参与一系列生理和病理过程[7][8]。
转移抑素(Metastin)是由Kiss-1基因编码的蛋白,该蛋白主要是通过与其受体作用后调节钙离子水平,使钙离子浓度增加来抑制侵袭性细胞趋化、增殖及转移从而起到抑制病灶细胞转移的作用[9]。
米非司酮(mifepristone)是孕酮受体(PR)的拮抗剂,可减少内膜血管生成,使内膜螺旋动脉萎缩,使子宫血流下降,使内膜变薄有抗子宫内膜增殖作用[10]。
本课题旨在通过检测体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞中HPA、metastin的表达以及米非司酮对其表达的影响,探讨子宫腺肌病发病中是否存在侵袭性因素、米非司酮对该因素能否干预及其可能的干预机制。
目的检测体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞、对照组子宫内膜腺上皮细胞中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)和转移抑素(metastin)的表达及米非司酮对病例组中该二种蛋白表达的影响,了解子宫腺肌病发病中可能存在的侵袭性因素并探讨米非司酮对该因素的干预机制。
方法体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞及对照组(子宫肌瘤组)子宫内膜腺上皮细胞,并对部分病例组培养中细胞以米非司酮干预(各组按增殖期、分泌期区分培养)。
用western-blot法定量检测HPA和metastin在子宫腺肌病组、药物干预组、对照组(子宫肌瘤组)培养细胞中的表达。
用统计方法分析这两个指标在各组中表达的差异性。
结果
(1)子宫腺肌病组增殖期和分泌期在位内膜腺上皮细胞中HPA表达均高于对照组(p<0.05),metastin表达低于对照组(p<0.05)。
(2)对子宫腺肌病组增殖期和分泌期细胞分别进行米非司酮药物干预后,HPA表达均降低,metastin表达增高,与未用药前相比差异有统计学意义(p<0.05)。
(3)子宫腺肌病组细胞中HPA和metastin的表达在增殖期和分泌期相比差异无统计学意义(p>0.05)。
结论子宫内膜腺上皮细胞中侵袭性因素和侵袭抑制因素表达失衡可能是子宫腺肌病的发病机制之一;HPA和metastin在子宫内膜腺上皮细胞中的表达本实验数据不显示受月经周期的影响;米非司酮对HPA和metastin这对侵袭和侵袭抑制因素的干预作用可能成为米非司酮抑制子宫腺肌病发生发展的机制之一。
关键词子宫腺肌病乙酰肝素酶转移抑素米非司酮
HeparanaseandtheMetastinexpressinentopicendometrialglandularepitheliumcellofadenomyosisraisedInvitroandtheincidenceofmifepristonefortheirexpressionandsignificance
Abstract
BachgroundAdenomyosis(AM),thatisendometrialmyometrialinvasionmorethanuptoahighpowerfield,pathologicaldiagnosisofendometrialglandsandstromaappearsatnexttheendometrialbasallayerofthe≥3mm.Theetiologyandpathogenesisisunclear,mayberelatedtomechanicalfactors,endocrinefactors,apoptosisfactors,immunefactors,andsoon.Withtheprogressofthestudy,manyacademicsbelievethattheoccurrenceofadenomyosishaverelatedtoendometrialglandsandstromahavinginvasiveness.
Heparanase(Hpa)asaglucuronicacidesterase,bycrackingacetylheparansulphateproteoglycans,releaseandactivationofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),basicfibroblastgrowthfactor,promotecellgrowthandtransfer,whilemediatedcelladhesion,inextracellularmatrixcell-cellcontact,growthanddifferentiationprocessplayanimportantrole,involvedinaseriesofphysiologicalandpathologicalprocesses.
MetastinisproteinencodesfromKiss-1gene,theproteinmainlythroughactingontheirreceptorstoregulatecalciumlevels,sothatincreaseintheconcentrationofcalciumionstosuppresstheinvasivecellchemotaxis,proliferationandtransfertoplayinhibitmetastasisoftumorcells.
Mifepristoneisaprogesteronereceptor(PR)antagonist,canreduceendometrialangiogenesis,makeendometrialspiralarteriestoshrink,uterinebloodflowdecreasedandendometrialthinnedsothattakeendometriumanti-proliferativeeffect.
ThistopicwasdesignedtodetecttheHPA,metastinexpressioninadenomyosisinvitroeutopicendometrialglandularepithelialcellsandtheeffectsofmifepristoneontheirexpression,toexplorethepathogenesisofadenomyosisinthepresenceofinvasivefactors,ifMifepristonecouldinterventthesefactorswithitspossiblemechanismsofintervention..
ObjectiveDetectiontheexpressionofHPAandmetastininadenomyosisinvitroeutopicendometrialglandularepithelialcellsandinthecontrolgroupofendometrialglandularepithelialcellsandtheeffectsofmifepristoneonthetwokindsofproteinexpressionincasegroup,tounderstandthepathogenesisofadenomyosisthatmayexistinaggressivefactorsandtoexploretheinterferemechanismofmifepristonetofactors.
MethodsCulturinginvitroAdenomyosiseutopicendometrialglandularepithelialcellsandthecontrolgroup(uterinefibroidsgroup)endometrialglandularepithelialcells,andsomeofcasesgroupscellsculturedwithmifepristoneintervention(ineachgroupaccordingtoproliferativephase,distinguishsecretoryphaseculture).Bywestern-blotdetectquantitativelyofHPAandthemetastinintheadenomyosisgroup,druginterventiongroupandthecontrolgroup(uterinefibroidsgroup)culturedcells.Usingstatisticalanalysisofthetwoindicatorsineachgroupexpressiondifferences.
Results
(1)HPAexpressedinadenomyosisgrouphigherthancontrolgroupbothatproliferativephaseandsecretoryphaseeutopicendometrialglandularepithelialcells(p<0.05),metastinexpressionlowerthanthecontrolgroup(p<0.05).
(2)adenomyosisgroupofproliferativephaseandsecretoryphasecellswerefordrugintervention,HPAexpressionreduced,metastinexpressionincreased,ascomparedwithnon-medicationgroupthedifferencewasstatisticallysignificant(p<0.05).(3)groupofcellsinadenomyosisHPAandmetastinexpressioninproliferativephaseandsecretoryphasewasnotstatisticallysignificantwhencompared(p>0.05)
ConclusionExpressionimbalanceofinvasivefactorsandinvasiveinhibitingfactorinendometrialglandularcellsmaybeoneofpathogenesisofadenomyosis,interventionofmifepristoneontheHPAandmetastinmaybeoneofthemechanismsthatMifepristoneinhibitthedevelopmentofadenomyosis
KeywordsadenomyosisheparanasemetastinMifepristone
前言
子宫腺肌病(Adenomyosis)即子宫内膜侵入肌层达一个高倍视野以上,病理诊断子宫内膜基底层下≥3mm处出现子宫内膜腺体和间质。
该病是一种妇科常见疾病,主要表现是进行性痛经加重,经量增多,经期延长,以及不孕等。
子宫腺肌病从青春期至绝经后均有发病,但以育龄妇女多见,其发病率为5%-70%[11]。
子宫腺肌病以往称内在性子宫内膜异位症,属于子宫内膜异位症的一种特殊类型,现在因二者虽常合并存在但在发病机制和组织发生学上及临床表现上均不尽相同而将子宫腺肌病独立出来。
该病首次由Frank命名,1972年Bird等描述其为“子宫内膜对子宫肌层的良性浸润,产生弥散性子宫增大,显微镜下显现为肥大增生的子宫肌层环绕着异位、非恶性的内膜样腺体和间质”。
子宫内膜以两种形式侵入子宫肌壁层,即弥漫型和局限型,前者为异位内膜侵入整个子宫的肌壁内,在不同部位其侵入范围和深浅可不同;后者异位内膜仅侵及某一部分的肌壁,形同子宫肌瘤,但其与周围正常组织并无分界。
子宫腺肌病现病因和发病机理尚不清,随着研究的进展,已有学者分别从机械因素、内分泌因素、细胞凋亡因素、免疫因素、间质因素、遗传因素,细胞周期因素[12]等方面做过论述:
即与子宫内膜和肌层连接区结构受损;血管异常增生;子宫内膜细胞增殖和调亡的改变;体内雌激素、孕激素及催乳素水平改变及其受体分布的改变;机体体液免疫和细胞免疫功能异常;基底内膜腺体内陷;遗传因素以及子宫内膜细胞侵袭及粘附力的改变等有关[13]。
但是目前还没有一种全面的病理生理机制的解释,现很多学者认为子宫腺肌病的发生与子宫内膜腺体和基质具有类似肿瘤细胞的侵袭性行为有很大的关系。
临床子宫腺肌病离体子宫病理连续切片发现子宫内膜与异位病灶之间存在子宫内膜腺体和间质的连接。
因此有学者认为异位病灶是由原位子宫内膜侵入肌层并在肌层进一步向周围侵蚀生长,子宫内膜异位侵袭机制可能是子宫腺肌病发病的重要机理之一[14]。
本研究拟从子宫内膜细胞侵袭力的改变方面,来探讨子宫腺肌病的发病机制。
乙酰肝素酶(HPA)是迄今发现唯一能裂解细胞外基质(ECM)内蛋白多糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的内源性糖苷内切酶[15]。
HPA作为一种葡萄糖醛酸酯酶,通过裂解乙酰硫酸肝素盐蛋白聚糖,释放和激活血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF),促进细胞的生长及转移,同时介导细胞粘附,在细胞外基质细胞的接触、生长和分化过程中起重要作用,参与一系列生理和病理过程。
且大量研究发现,乙酰肝素酶在恶性肿瘤组织中呈现高表达[16][17],并且其表达强度与肿瘤临床分期、淋巴结转移及血管形成有很大关系。
Metastin是1996年在黑色素瘤细胞株发现的一个肿瘤转移抑制蛋白,是Kiss-1基因的表达产物。
该蛋白在正常组织中有广泛表达。
目前认为metastin蛋白抑制肿瘤转移的作用主要是通过metastin与其受体作用后调节钙离子水平,使钙离子浓度增加来抑制肿瘤细胞趋化、增殖及转移[18]。
大量研究证明Kiss-1与黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌的转移密切相关[19][20]。
米非司酮是19-去甲睾酮的衍生物,是法国Roussel-Uclaf公司在1981年研制成功的一种作用于受体水平的抗孕酮和抗糖皮质激素的甾体类药物,通过与受体竞争而起到阻断孕酮的作用。
子宫腺肌病现出现年轻化倾向,患者常有保留生育功能的要求,手术治疗存在一定的局限性,药物治疗就显得十分必要。
近年来应用米非司酮治疗子宫腺肌病获得了巨大进展,是目前研究较多的用于治疗和防止子宫腺肌病复发的药物,但它治疗子宫腺肌病的具体作用机制及疗效尚不肯定。
本课题旨在通过检测体外培养子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞中HPA和metastin的表达以及米非司酮对其表达的影响,了解子宫腺肌病发病中是否存在侵袭性和侵袭抑制因素的异常变化、这种变化是否受月经周期的影响、米非司酮对该因素能否干预,探讨子宫腺肌病可能的发病机制及米非司酮对该病可能的干预机制。
材料与方法
1.材料
1.1标本来源:
选择2007年12月至2008年9月在山西医科大学第一医院妇科术前诊断为子宫腺肌病者15例作为病例研究组,其中增殖期8例,分泌期7例,年龄38~44岁;子宫肌瘤患者10例作为对照组,增殖期和分泌期各5例,年龄42~45岁;米非司酮干预组为用米非司酮(1×10-4mol/L)干预体外培养的病例组子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞的二分之一量。
各组均临床资料完整,术前3个月均未用过激素类药物,无子宫内膜疾病,无内分泌疾病,术后病理检查均符合术前诊断,都除外与子宫内膜异位症以及子宫肌瘤合并存在的病例,实验标本均经患者同意用作研究培养。
手术室无菌获取标本:
手术切除子宫后立即“Y”形剖开子宫前壁,用手术刀于子宫内壁刮取内膜组织,分成两份,一份10%甲醛固定送病理检查,另一份放入无菌磷酸盐缓冲液(PBS),30min内送回实验室进行细胞分离培养。
1.2主要试剂及要仪器
1.2.1主要试剂:
DMEM培养基武汉博士德生物工程有限公司
胎牛血清杭州四季青公司
Ⅳ型胶原酶Gibco公司
PBS溶液山西医科大学中心实验室
TBST溶液山西医科大学中心实验室
0.25%胰蛋白酶
细胞角蛋白19抗体
SDS-PAGE凝胶山西医科大学中心实验室
Hpa抗体
Metastin抗体
羊抗兔二抗
硝酸纤维
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