中药肉苁蓉多糖和总苷的提取分离及质量控制方法研究毕业论文.docx
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中药肉苁蓉多糖和总苷的提取分离及质量控制方法研究毕业论文
毕业论文
中药肉苁蓉多糖和总苷的提取分离及质量控制方法研究
毕业设计(论文)原创性声明和使用授权说明
原创性声明
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所呈交的毕业设计(论文),是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。
尽我所知,除文中特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果,也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。
对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体,均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
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作者签名:
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摘要
肉苁蓉为多年生草本植物,分布于新疆、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏等地,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能。
本论文研究内容主要包括以下4个方面:
1、肉苁蓉多糖的研究
肉苁蓉多糖是肉苁蓉的有效成分之一,本文采用水提醇沉法对多糖进行提取分离,通过紫外分光光度法测定粗多糖和可溶性多糖的含量。
结果表明,粗多糖和可溶性多糖的含量分别为4.56%和17.41%;在肉苁蓉多糖提取研究的基础上对肉苁蓉多糖部位进行了研究,通过调节醇沉阶段的含醇量进行分段,用蒽酮-硫酸法对各部分多糖部位进行了含量测定。
结果显示,用20%乙醇沉淀所得多糖的含量最高,达到样品量的9.71%,占总多糖的44.0%。
2、肉苁蓉中毛蕊花糖苷的研究
采用超声辅助提取法对肉苁蓉有效成分进行提取,用高效毛细管电泳法对肉苁蓉中毛蕊花糖苷进行含量测定。
详细考察了分离电压在8~25kV范围和硼酸-硼砂缓冲溶液的pH在8.0~10.0之间对毛蕊花糖苷的分离影响,得到最佳分离条件为:
电压8kV,运行缓冲溶液为30mmol/L的硼酸-硼砂(pH=9.0),室温,检测波长为334nm。
毛蕊花糖苷的浓度在0.015~0.375mg/mL范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程y=13946x+560.32,(R2=0.9983),样品回收率为99.26%,RSD=1.16%,精密度RSD=0.96%。
通过上述研究,建立了毛蕊花苷的高效毛细管电泳含量测定方法,并用此方法测得肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量为样品的1.02~1.04%。
3、肉苁蓉中红景天苷的测定方法研究
采用HPLC和HPCE两种方法对肉苁蓉中红景天苷的测定方法进行了研究。
用HPLC法对肉苁蓉中红景天苷的测定研究,采用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱,流动相为乙腈∶水(1∶9),流速为1.0mL/min,室温,红景天苷的检测波长为278nm。
红景天苷在0.055~0.44µg范围呈良好的线性关系,其线性回归方程y=91207x-1097,(R2=0.9953),样品的回收率为94.8%,RSD=1.50%,精密度RSD=0.39%。
通过研究得出HPCE法测定红景天苷的最佳条件:
分离电压8kV,运行缓冲溶液30mmol/L的硼酸-硼砂(pH=9.0),室温,检测波长为278nm。
红景天苷的浓度在0.007~0.14mg/mL范围呈良好的线性关系,其线性回归方程y=42915x-92.541,(R2=0.9903)。
样品的回收率为100.1%,RSD=1.45%,精密度RSD=0.96%。
对两种分离测定红景天苷的方法进行了比较,结果显示高效液相色谱法与毛细管电泳法对肉苁蓉中红景天苷的分离效果均较好,测定结果无明显差异,其含量均为0.103~0.120%。
4、肉苁蓉的指纹图谱研究
本文采用HPCE方法,对肉苁蓉样品的提取成分进行了分离分析,以肉苁蓉的主要有效成份毛蕊花糖苷作为评价指标,建立了肉苁蓉药材的HPCE指纹图谱,其分离度和重现性均较好,各峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5%,为肉苁蓉药材的质量标准的建立提供了科学依据。
关键词:
肉苁蓉;多糖;毛蕊花糖苷;红景天苷;指纹图谱
Abstract
HerbaCistanche,asperennialherbs,distributeinXinjiang,InnerMongolia,Shaanxi,Gansu,Ningxiaandotherplaces,withkidney-yang,essenceandblood,andRunchangpurgefunction.
Thisthesisincludesfourparts:
1.StudyonthepolysaccharidesofHerbaCistanche
CistanchedeserticolapolysaccharidesaretheactiveingredientsinHerbaCistanche.Polysaccharideswereseparatedbyusingaqueousalcoholextractionmethodandthecontentofcrudepolysaccharideandsolublepolysaccharidewasdeterminedwithultravioletspectrometry.TheresultsshowedthatthecontentofcrudepolysaccharideandsolublepolysaccharideinHerbaCistancheis4.56%and17.41%separately.BasedonthestudyoftheextractionofpolysaccharideinCistanche,polysaccharidescontentisthehighestwhen20%ethanolwasused,whichcangotoupto9.71%ofsampleand44.0%oftotalpolysaccharides.
2.StudyontheActeosideofHerbaCistanche
Ultrasound-assistedextractionofactiveingredientswasemployed,andacteosideinHerbaCistanchewasdeterminedbyhighperformancecapillaryelectrophoresis.Afterdetailedstudyoftheimpactoftheseparationvoltageintherangeof8~25kVandboricacid-boraxbuffersolutionofpH8.0~10.0ontheseparationofacteoside,thebestseparationconditionswereasfollows:
voltageat8kV,runningbuffersolutionwith30mmol/Lofboricacid-borax(pH=9.0),roomtemperature,anddetectionwavelengthat334nm.Acteosideconcentrationintherangeof0.015~0.35mg/mLshowedgoodlinearrelationship.Thelinearregressionequationisy=13946x+560.32(R2=0.9983),andsamplerecoveryyieldwas99.26%withRSD(1.16%)andprecisionofRSD(0.96%).Throughthisresearch,weestablishedthemeasurementofacteosidebyhighperformancecapillaryelectrophoresismethod,andthecontentofMulleinglycosideincistanchewasdeterminedtobe1.02~1.04%bytheabovemethod.
3.StudyonthedeterminationofsalidrosideinHerbaCistanche
TheuseofHPLCandHPCEmethodsforthedeterminationofsalidrosideinHerbaCistanchewasstudied.ForHPLCmethod,columnloadedwithoctadecylsilanebondedsilica,mobilephaseofacetonitrile:
water(1:
9),flowrate1.0mL/minatroomtemperature,andthedetectionwavelengthat278nmwereemployed.Theresultsindicatedthatsalidrosideintherangeof0.055~0.44μgwasingoodlinearrelationshipwiththelinearregressionequationy=91207x-1097,(R2=0.9953),andsamplerecoveryyieldwas94.8%,RSD=1.50%,andprecisiondegreeofRSD=0.39%.
Throughourstudy,thebestconditionsforHPCEmethodwereasfollows:
separationvoltageat8kV,runningbuffer30mmol/Lofboricacid-borax(pH=9.0),roomtemperature,anddetectionwavelengthat278nm.Theresultsshowedsalidrosideconcentrationintherangeof0.007~0.14mg/mLwasingoodlinearrelationshipwiththelinearregressionequationy=42915x-92.541,(R2=0.9903).Samplerecoveryyieldwas100.1%,RSD=1.45%,andprecisionofRSD=0.96%.
Incomparisonofseparationanddeterminationofsalidrosidebytwomethods,theresultsshowedthatbothhigh-performanceliquidchromatographyandcapillaryelectrophoresiscanwellworkonsalidrosidecistancheseparationwithoutsignificantdifferencesinmeasurements,anditscontentrangesfrom0.120%to0.103%.
4.StudyonthefingerprintofHerbaCistanche
Inthispaper,HPCEmethodwasemployedtoanalyzetheingredientinCistanchesamples.Themainactiveingredient,theActeosideofHerbaCistanche,wassetasevaluationindextoestablishtheHPCEcistanchefingerprint,andtheseparationdegreeandreproducibilityarereliableandexcellent.TheRSDofallrelativepeakareaandtherelativeretentiontimearelessthan5%.OurresearchprovidesasolidscientificbasistotheestablishmentofqualitystandardsofmedicinalCistanche.
Keywords:
HerbaCistanche,polysaccharides,acteoside,salidroside,fingerprint
目录
摘要I
AbstractIII
第一章前言1
1.1化学成分2
1.1.1苯乙醇苷类2
1.1.2多糖2
1.1.3环烯醚萜类3
1.1.4木质素3
1.1.5挥发油成分3
1.1.6其它类3
1.2提取、分离纯化新技术4
1.2.1超临界流体萃取技术4
1.2.2超声辅助提取技术4
1.2.3微波辅助提取技术5
1.2.4大孔树脂吸附分离技术5
1.2.5高速逆流色谱分离技术6
1.2.6高效液相色谱技术6
1.2.7高效毛细管电泳技术7
1.3含量测定7
1.4中药指纹图谱的研究7
第二章肉苁蓉多糖的研究10
2.1引言10
2.2实验部分10
2.2.1实验材料10
2.2.2实验方法10
2.3多糖含量测定方法的研究11
2.3.1测定波长的选择11
2.3.2线性关系的考察12
2.3.3精密度试验12
2.3.4稳定性试验13
2.3.5加样回收试验13
2.4结果14
2.4.1计算公式14
2.4.2肉苁蓉可溶性多糖和粗多糖含量的测定14
2.4.3不同多糖部位的含量的测定14
2.5讨论15
第三章高效毛细管电泳法测定肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量16
3.1引言16
3.2实验部分16
3.2.1实验与仪器16
3.2.2实验方法16
3.3方法学考察与结果17
3.3.1检测波长的选择17
3.3.2电压对分离的影响17
3.3.3缓冲溶液pH值对分离的影响17
3.3.4色谱条件18
3.3.5标准曲线的绘制19
3.3.6精密度试验20
3.3.7重现性试验20
3.3.8稳定性试验20
3.3.9加样回收试验20
3.3.10样品溶液的测定20
3.4结论21
第四章高效毛细管电泳法测定肉苁蓉中红景天苷的含量22
4.1引言22
4.2实验部分22
4.2.1实验材料22
4.2.2实验方法22
4.3方法学考察与结果23
4.3.1检测波长的选择23
4.3.2色谱条件23
4.3.3标准曲线的绘制23
4.3.4精密度试验24
4.3.5重现性试验24
4.3.6稳定性试验24
4.3.7加样回收试验24
4.3.8样品溶液的测定25
4.4结论25
第五章高效液相色谱法测定肉苁蓉中红景天苷的含量26
5.1引言26
5.2实验部分26
5.2.1实验材料26
5.2.2实验方法26
5.3方法学考察与结果26
5.3.1检测波长的选择26
5.3.2色谱条件26
5.3.3流动相的选择27
5.3.4参照物的选择27
5.3.5线性关系的考察27
5.3.6精密度试验28
5.3.7重现性试验28
5.3.8回收率试验28
5.3.9样品测定29
5.4讨论29
5.4.1系统适应性试验结果比较29
5.4.2回收率的比较29
5.4.3重现性试验的比较30
5.4.4线性关系的比较30
第六章肉苁蓉高效毛细管电泳指纹图谱研究31
6.1引言31
6.2实验材料31
6.2.1仪器31
6.2..2试剂与药材31
6.3肉苁蓉HPCE指纹图谱的构建31
6.3.1溶液的制备31
6.3.2指纹图谱构建的条件32
6.3.3肉苁蓉水溶性HPCE指纹图谱的建立32
6.4肉苁蓉水溶性成分HPCE指纹图谱建立依据34
6.4.1样品药品的来源34
6.4.2样品溶液的制备34
6.4.3参照品溶液的制备34
6.4.4测定条件34
6.4.5方法学考察34
6.5结论41
第七章结论与展望42
7.1结论42
7.2存在的问题与建议42
参考文献44
致谢49
作者简历50
导师评阅表51
第一章前言
肉苁蓉(HerbaCistanche)为列当科(Oroban-chaceae)植物肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.ia)的带鳞片的干燥肉质茎,又名苁蓉、大芸、金笋、地精[1]。
本属植物全世界约有18个种,我国约有4个种1个变种,分别为肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)、盐生肉苁蓉[C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck]、管花肉苁蓉[C.tubulosa(Schenk)R.Wight]、白花盐肉苁蓉(C.salsavar.albifloraP.F.TuetZ.C.Lou)及沙苁蓉(C.sinensisG.Beck),《中药大辞典》收载有3种:
盐生肉苁蓉、肉苁蓉、迷肉苁蓉[C.ambigua(Bge.)B.Beck]。
《中华人民共和国药典》(2005年版)收载了肉苁蓉为药用肉苁蓉。
肉苁蓉为多年生草本植物,生于盐碱地、干河沟、沙地、戈壁滩一带,寄生于梭梭、盐爪爪属植物、禾本科植物、柽柳科植物等植物的根上。
分布于新疆、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏等地。
肉苁蓉始载于《神农本草经》,列为上品。
《本草经疏》提到:
“肉苁蓉,滋肾补精血元之要药,气本做温,相传以为热者误也。
甘能除热补中,酸能入肝,咸能滋肾,肾肝为阴,阴气滋长,则五脏元劳热自退,肾肝足,则精血日盛。
”《本草汇言》提到:
“肉苁蓉,养命门,滋肾气,补精血之药也。
”《玉楸药解》“肉苁蓉滋木清风,养血润肠,善滑大肠”。
《本草正义》提到:
“能精血而通阳气,故曰益精气”。
在《本草纲目》中李时珍提到“此物补而不峻,故有从容之兮”。
肉苁蓉味甘、咸,性温,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能[2],由此可见肉苁蓉在中药的发展中起着非常的作用。
1985年版《中华人民共和国药典》就收载肉苁蓉为中药材,其制剂有“镇阳固精丸”等。
在1991年至2008年中华人民共和国部颁标准中的6152品种的药品中,大约有44种以肉苁蓉为主药的药品,如补肾益精丸,回春如意胶囊,益肾壮阳胶囊,便秘通,长春药酒等,含肉苁蓉的药物发展逐渐走向产业化,发展更多的制剂型药物,适合不同情况的人的需要。
肉苁蓉作为一种中药从简单的传统煮药,发展到提取有效成分,制成胶囊、口服液、酊剂等。
由于中药受到产地、采摘时间的不同、气候及其它条件的影响,其化学成份及其含量均有差别,需要用科学的手段来控制有效成分,为向世界上发达国家管理药品的水平看齐,这样才能使含肉苁蓉的药品及其制剂型的产业化。
在2000年版和2005年版《中华人民共和国药典》中肉苁蓉的质量标准很清楚,用肉苁蓉的活性物质(毛蕊花苷和松果菊苷)进行质量控制,可以对含有肉苁蓉的药物,用毛蕊花糖苷和松果菊苷含量进行药物的优劣进行鉴定。
从20世纪80年代开始,国内外对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究,随着分离提取和检测技术的飞速发展,已分离出多种类型的物质,主要可分为苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等。
环烯醚萜类化合物广泛存在于植物界中,其在植物分类学的重要作用及多种生物活性,近年来研究发展迅速,研究表明环烯醚萜苷类化合物具抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、利胆、通便及镇静等多种生理活性[3];多糖类成分在增强机体免疫功能、抗肿瘤方面的作用愈来愈受到人们的重视,其中对免疫增强作用机理的研究已深入到分子、受体水平;甜菜碱具有抗脂肪肝和抗肿瘤以及扩张外周血管和降压的作用;微量元素在人体内起着极其重要的双向调节作用,可纠正体内失调的物质代谢平衡,达到祛病健身,延年益寿之功效,中草药中的微量元素通常又与有机活性基团结合,使其活性高增,易于吸收。
结合相关文献,对肉苁蓉属的化学成分作了全面系统的介绍,其中对苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木质素及其苷类,对肉苁蓉药材质量控制标准和含量测定及中药的提取方法和含量测定作了综述。
为肉苁蓉资源的保护、引种栽培、品质的控制及新药的研发提供了科学依据。
1.1化学成分
1.1.1苯乙醇苷类
现代研究表明,肉苁蓉具有壮阳、抗衰老、提高免疫功能,增强记忆力,降血脂和通便等作用[4],有“沙漠人参”之美誉,其主要活性成分是苯乙醇苷类(PhGs)[5]。
据文献报道,苯乙醇苷类具有抗不良刺激、增强学习记忆力和助阳等多方面功能,肉苁蓉含这类成分较多。
国内学者对C.desertieola研究较多,堵年生等从中分得松果菊苷、肉苁蓉苷A、类叶升麻苷、2-乙酰类叶升麻苷[6];徐文豪等从中分得类叶升麻苷、2-乙酰类叶升麻苷、松果菊苷、肉苁蓉苷A、B、C、H等[7];徐朝晖从中分得红景天苷[8]等。
由于PhGs的紫外吸收很强,尤其适用于高效液相色谱法(HPLC)分析,已有多位学者对本属各植物中的PhGs成分肉苁蓉属植物的PhGs,发现所研究的7个植物样品皆含有大量的PhGs,其中土耳其产盐生肉苁蓉的PhGs总量最高,国产盐生肉苁蓉、卡塔尔产鳔苁蓉、巴基斯坦产和巴林产管花肉苁蓉的PhGs总量较多,而国产荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉的PhGs总量较少;他们还对每个植物中所含的7个PhGs化合物进行了定量分析,结果发现7个PhGs的含结果表明5种生药皆含有多种PhGs,其中荒漠肉苁蓉、栽培的荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉、盐生油肉苁蓉、白花盐苁蓉和管花肉苁蓉所含PhGs成分相似,而沙苁蓉与其他种差别较大。
此外对5个PhGs成分进行了含量测定,5种生药的含量各不相同。
国外学者对C.salsa的研究:
日本小林弘美(HiromiKobayashi)等对我国内蒙产C
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