实验二十八植物染色体压片法.docx

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实验二十八植物染色体压片法

遗传学实验指导

实验须知

一、实验课的目的

1、培养锻炼科学的思维方法、实事求是的科学态度和严格的科学作风，提高分析问题解决问题的能力。

2、通过实验加深对理论的理解，学习掌握基本的分子生物学实验技能与实验方法，为今后的学习和研究打下一定的基础。

3、培养学生爱护公物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。

二、实验课的要求

1、课前必须预习，了解基本原理和主要步骤及意义，写出预习报告。

2、上实验课必须穿白大衣，带实验讲义和实验报告纸。

3、遵守实验制度，注意安全（如水、电、煤气、强酸、强碱、有毒物质等）。

4、实验中要正规操作，动手动脑主动进行实验；掌握关键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考，及时做好记录；综合分析得出正确结论。

5、在实验过程中不许大声喧哗，有问题及时请教老师。

6、器材、药品等按规定使用，严禁乱用乱放。

7、爱护仪器，实验过程中因个人未能按实验要求操作而导致的器材损坏，按规章制度进行赔偿。

8、实验结束后，相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。

9、废弃物按要求分类收集、处理。

10、值日生要打扫干净实验台、地面等，并负责关好门窗，检查水、电、煤气等。

11、因故不能上实验者应有请假手续，是否进行补课由教研室研究决定。

实验须知1

实验一洋葱根尖压片与有丝分裂观察3

实验二染色体组型分析5

实验三减数分裂7

实验四人工诱发多倍体植物9

实验五植物的离体培养和快速繁殖11

实验预习报告格式要求13

实验报告格式要求13

实验一洋葱根尖压片与有丝分裂观察

一、实验原理

植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。

二、实验目的

1、学习根尖染色体压片法。

2、掌握有丝分裂过程。

三、实验材料

洋葱（Aillumcepa）的鳞基

四、实验器具和药品

1.用具：

染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。

2.药品：

无水酒精，70％酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，碱性品红，石碳酸，甲醛，山梨醇，二甲苯。

卡诺固定液的配制：

用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。

染色液的配制：

配方Ⅰ.石碳酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液A和B。

母液A：

称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70％酒精中（此液可长期保存）。

母液B：

取母液A10毫升，加入90毫升的5％石碳酸水溶液（2周内使用）。

石碳酸品红染色液：

取母液B45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37％的甲醛。

此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石碳酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。

配方Ⅱ：

改良石碳酸品红

取配方Ⅰ.石碳酸品红染色液2—10毫升，加入90—98毫升45％的醋酸和1.8克山梨醇（sorbitol）。

此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。

五、实验说明

1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。

2.植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。

3.前处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理3—4小时。

可处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。

4.解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。

（1）酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。

根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。

（2）酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片，使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，致使多项制片措施直接作用于染色体。

六、实验步骤

（一）将洋葱的鳞基，置于盛水的小烧杯上，放在25℃温箱中，待根长到2cm左右时，在上午九时摘下根尖，放到卡诺固定液中，固定24小时。

固定材料可以转入70％酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。

（二）解离

酸解：

从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1mol/LHCl中，在60℃水浴中解离8—10分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板上，加上几滴改良石碳酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。

（三）压片，把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分截去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。

一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的，必需掌握以下几点：

1.压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。

2.用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。

（四）镜检观察：

要求找到有丝分裂的各个时期的典型图像。

七、作业：

1、绘制有丝分裂中期图。

八、实验要求：

1、学生要分组参与实验准备，参加的小组负责在课堂上向全班报告实验准备情况。

2、课前写出预习报告，课前上交，方可参加实验，并准备课堂上的实验原理与实验基本步骤的提问。

3、携带必备的工具参加实验，如铅笔、实验报告纸、白大衣、教材等。

4、在课堂上完成作业。

5、在镜检观察时，如找到所要求的图像，要请老师检查一下再画图。

实验二染色体组型分析

一、实验原理

各种生物的染色体数目是恒定的。

大多数高等动植物是二倍体（diploid）。

也就是说，每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。

其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。

每一个配子带有一组染色体，叫做单倍体（haploid），用n表示。

两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。

如蚕豆的体细胞2n=12，它的配子n=6，玉米的体细胞2n=20，配子n=10。

水稻2n=24，n=12。

有些高等植物还是多倍体。

染色体在复制以后，纵向并列的两个染色单体（chromatids），往往通过着丝粒（centromere）联在一起。

着丝粒在染色体上的位置是固定的。

由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂（arms），造成中间着丝粒，亚中间着丝粒、亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。

此外，有的染色体还含有随体或次级缢痕。

所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。

染色体组型分析是细胞遗传学、现代分类学和进化理论的重要研究手段，也是一种简便的方法。

二、实验目的

1.学习分析染色体组型，计算有关数据。

三、实验材料

由实验室提供染色体制片或放大照片。

四、实验器具和药品

镊子，剪刀，绘图纸。

五、实验说明

染色体组型分析方法分为两大类，一类是分析体细胞有丝分裂时期的染色体数目和形态。

另一类是分析减数分裂时期的染色体数目和形态，均能得到染色体组型。

这里我们要做的是有丝分裂时期的分析。

各染色体的长臂与短臂之比称为臂率。

臂率为1.0—1.7的归为中间着丝粒染色体，用（M）表示。

1.7—3.0的归为亚中间着丝粒染色体，用（SM）表示。

3.0—7.0的归为亚端部着丝粒染色体，用（St）表示。

7.0—更大的归为端部着丝粒染色体，用（Ot）表示。

用SAT代表具随体的染色体，计算染色体长度时，可以包括随体也可以不包括，但均要注明。

六、实验步骤

（一）有丝分裂时期染色体组型分析

1.测量：

根据放大照片测量、记录染色体形态测量数据如下：

（3）总染色体长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和

（5）列表（表格于实验结果中）

（6）配对：

根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次缢痕的有无及位置、随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴配对。

（7）染色体排列：

染色体对从大到小，短臂向上、长臂向下，各染色体的着丝粒排在一条直线上。

有特殊标记的染色体（如含有随体的）以及性染色体等可单独排列。

（8）翻拍或绘图。

完成上述步骤的染色体剪贴，可以通过翻拍摄影或描图成为染色体组型图。

高等植物属异源多倍体种类的较多，进行组型分析时，不完全根据染色体的大小进行排列，而事先要根据系统发育的来源进行分组，然后各组按大小进行编排。

例如，人工培育的小黑麦。

来自小麦的染色体组是AABBDD，来自于黑麦的染色体组是RR，组型分析时不仅应将RR分开，而且小麦本身是个天然的异源多倍体，又应分成AA、BB、DD组几组进行分析。

经常见到的植物如棉花、烟草、马铃薯以及许多果树、花卉均具有多倍体品种，分析时应特别注意。

七、作业

列表并说明。

八、实验要求：

1、课前写出预习报告，课前上交，方可参加实验，并准备课堂上的实验原理与实验基本步骤的提问。

2、携带必备的工具参加实验，如尺、铅笔、实验报告纸、白大衣、教材等。

3、在课堂上完成作业。

4、在镜检观察时，如找到所要求的图像，要请老师检查。

实验三减数分裂

一、实验原理

减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂，仅在配子形成过程中发生。

这一过程的特点是：

连续进行两次核分裂，而染色体只复制一次，结果形成四个核，每个核只含单倍数的染色体，即染色体数减少一半，所以称作减数分裂。

另外一个特点是前期特别长，而且变化复杂，包括同源染色体的配对、交换与分离等。

二、实验目的

1.学习油镜的使用。

2.掌握减数分裂的各时期特征。

三、实验材料

减数分裂装片

四、实验器具和药品

1.用具：

装片、吸水纸，显微镜。

2.药品：

二甲苯、石蜡油。

五、实验说明

在植物花粉形成过程中，花药内的一些细胞分化成小孢子母细胞（2n），每个小孢子母细胞进行二次连续的细胞分裂（第一次减数分裂和第二次减数分裂）。

每一小孢子母细胞产生四个子细胞，每个子细胞就是一个小孢子。

小孢子内的染色体数目是体细胞的一半。

在动物的有性生殖过程中，也有一个由双倍体到单倍体的减数过程。

动物的精巢分化出精母细胞，精母细胞减数分裂，形成单倍染色体的精子。

在适当的时机采集植物的花蕾或动物的精巢，经固定、染色压片后，就可以在显微镜下观察到细胞的减数分裂。

整个减数分裂可分为下列各个时期。

第一次减数分裂

前期Ⅰ细线期：

第一次分裂开始，染色质浓缩为几条细而长的细线。

每一染色体已复制为二个单体，但在显微镜下还看不出染色体的双重性。

偶线期：

染色体形态与细线期没有多大变化，同源染色体开始配对。

粗线期：

同源染色体配对完毕，这种配对的染色体叫双价体，每个双价体含有四个染色单体，但仅有两个着丝粒。

染色体继续短粗。

双线期：

配对的同源染色体开始分开。

由于染色单体间起过交换，同源染色体有交叉现象。

染色体螺旋化程度加深。

浓缩期：

又叫终变期，交叉向染色体端部移动，交叉数减少，染色体变得更短粗。

浓缩期末核膜消失。

中期Ⅰ各个双价体排列在赤道上，纺锤体形成，两个同源染色体上的着丝粒逐渐远离。

双价体开始分离。

染色体数仍为2n，但每一染色体含有两个染色单体。

后期Ⅰ两条同源染色体分开，分别移向两极。

每一染色体有一着丝粒，带着两个染色单体。

每一极得到n条染色体。

染色体数已减半。

末期Ⅰ染色体解旋，又呈丝状，核膜形成，胞质分裂，成为二个子细胞。

间期在第二次分裂开始以前，两个子细胞进入间期。

但有的植物如延龄草（Trillium）和大多数动物不经过末期和间期，直接进入第二次减数分裂的晚前期。

第二次减数分裂

前期Ⅱ染色体缩短变粗，染色体开始清晰起来。

每个染色体含有一个着丝粒和纵向排列的两条染色单体。

前期快结束，染色体更短粗，核膜消失。

中期Ⅱ染色体排列在赤道面上，每个染色体含一个着丝粒、两条染色单体。

两条染色单体开始分离。

此时细胞的染色体数为n，每一染色体有两条染色单体。

后期Ⅱ两条染色单体分离，移向两极，每极含n条染色体。

末期Ⅱ染色体逐渐解螺旋，变为细丝状，核膜重建，核仁重新形成。

胞质分裂，各成为两个子细胞。

减数分裂结束，一个细胞经减数分裂形成四个子细胞，每个子细胞中只有n个染色体。

因为细胞分裂两次，染色体只复制一次。

六、实验步骤

1、取减数分裂各时期装片观察，找到各时期典型图像，用油镜观察。

七、作业

1、写出油镜使用注意事项。

2、列表比较减数分裂与有丝分裂的区别。

八、实验要求：

1、课前写出预习报告，课前上交，方可参加实验，并准备课堂上的实验原理与实验基本步骤的提问。

3、携带必备的工具参加实验，如铅笔、实验报告纸、白大衣、教材等。

4、在课堂上完成作业。

实验四人工诱发多倍体植物

一、实验原理

自然界各种生物的染色体数目是相当恒定的，这是物种的重要特征。

例如玉米体细胞染色体有20个，配成10对。

遗传学上把一个配子的染色体数，称为染色体组（或称基因组）用n表示。

如玉米染色体组内包含10个染色体，它的基数n=10。

一个染色体组内每个染色体的形态和功能各不相同，但又互相协调，共同控制生物的生长和发育、遗传和变异。

由于各种生物的来源不同，细胞核内可能具有一个或一个以上的染色体组，凡是细胞核中含有一套完整染色体组的就叫做单倍体，也用n表示。

具有两套染色体组的生物体称为二倍体，以2n表示。

细胞内多于两套染色体组的生物体称为多倍体。

例如三倍体（3n）、四倍体（4n）、六倍体（6n）等，这类染色体数的变化是以染色体组为单位的增减，所以称作整倍体。

在整倍体中，又可按染色体组的来源，区分为同源多倍体和异源多倍体。

凡增加的染色体组来自同一物种或者是原来的染色体组加倍的结果，称为同源多倍体。

如果增加的染色体组来自不同的物种，则称为异源多倍体。

多倍体普遍存在于植物界，目前已知道被子植物中有1/3或更多的物种是多倍体，如小麦属（Triticum）染色体基数是7，属二倍体的有一粒小麦，四倍体的有二粒小麦，六倍体的有普通小麦。

除了自然界存在的多倍体物种之外，又可采用高温、低温、X射线照射、嫁接和切断等物理方法人工诱发多倍体植物。

在诱发多倍体方法中，以应用化学药剂更为有效。

如秋水仙素、萘嵌戊烷、异生长素、富民农等，都可诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。

秋水仙素是由百合科植物秋种番红花——秋水仙（Colchicumautumnale）的种子及器官中提炼出来的一种生物碱。

化学分子式为

具有麻醉作用，对植物种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等可产生诱变作用。

它的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不走向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。

若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组织，由多倍性组织分化产生的性细胞，所产生的配子是多倍性的，因而也可通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去。

多倍体已成功地应用于植物育种，用人工方法诱导的多倍体，可以得到一般二倍体所没有的优良经济性状，如粒大、穗长、抗病性强等。

三倍体西瓜、三倍体甜菜、八倍体小黑麦已在生产上应用。

二、实验目的

1.了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。

2.观察多倍体植物，鉴别植物染色体数目的变化及引起植物其它器官的变异。

三、实验材料

洋葱的鳞茎。

四、实验器具和药品

1.药品：

0.1％和0.025％秋水仙素溶液，1mol/LHCl溶液，改良石碳酸品红溶液（配方见实验一），碘化钾溶液。

五、实验说明

染色体加倍后必须进行鉴别。

同源多倍体主要是根据形态特性来判断，如叶色、叶形及气孔和花粉粒的大小。

最为可靠的方法，是制做根尖压片，然后检查细胞内的染色体数目，只有染色体数目加倍了，才能证明植株已诱变成四倍体。

六、实验步骤

（一）把洋葱2n=16鳞茎浸在0.1％秋水仙素溶液24小时。

（二）用自来水冲洗2—3次。

（三）同期浸泡未经处理的洋葱鳞茎作为对照。

（四）鉴定多倍体植物

1.观察四倍体洋葱、二倍体洋葱根尖的形态区别，细胞大小区别。

2.制作根尖细胞压片，检查染色体数目（见实验一）。

七、作业

1、列出染色体人工加倍的方法以及鉴别方法。

八、实验要求：

1、学生要分组参与实验准备，参加的小组负责在课堂上向全班报告实验准备情况。

2、课前写出预习报告，课前上交，方可参加实验，并准备课堂上的实验原理与实验基本步骤的提问。

3、携带必备的工具参加实验，如铅笔、实验报告纸、白大衣、教材等。

4、在课堂上完成作业。

5、在镜检观察时，如找到所要求的图像，要请老师检查。

实验五植物的离体培养和快速繁殖

一、实验原理

分化了的植物根、茎、叶细胞往往具有全能性，在一定条件下进行离体培养，给于一定的营养与激素，可以脱分化为愈伤组织，由愈伤组织制备成细胞悬浮液，在一定的条件下经振荡培养，逐渐形成具有两极性的胚状体，经过进一步的分化培养，给于不同的营养和激素成分，又可以生出完整的小植株。

植物的脱分化和分化培养，证明分化了的植物细胞仍具备形成全整植株所需要的全套基因。

在一定条件下，活动的基因可以关闭、已关闭的基因又可以重新启动、再行由胚到成熟植株发育过程中有关基因的先后活动程序。

二、实验目的

1.掌握无菌操作方法，将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。

三、实验材料

胡萝卜贮藏根每组二根。

四、实验器具和药品

每组铝饭盒3个，大培养皿2套，250毫升烧杯2只，漂白粉过滤液200毫升，70％酒精，酒精棉花，镊子2把，保安刀2把，小镊1把，无菌水。

脱分化培养基各组6瓶，30毫升/瓶

MS培养基：

每升中含

固体培养基：

MS液体加0.8％琼脂

脱分化培养：

MS培养基加2，4－D2毫克/升

BA0.2毫克/升

五、实验说明

培养基的主要区别在于激素的成分和含量上，说明各种激素的出现和含量改变对于植物组织分化起着重要的作用。

许多植物从脱分化到分化过程对培养基里激素成份要求严格、有的还要进行液体培养才能重新分化。

例如，胡萝卜贮藏根组织，是最早用于研究植物细胞的全能性的材料，至今仍是研究脱分化的好材料，但当胡萝卜组织形成愈伤组织之后，若要它们重新分化，必须经过振荡培养和采用合适的培养基，条件较为复杂。

另一些植物，例如烟草的根、茎、叶和甘蓝的花茎等容易进行脱分化和分化培养，不需液体振荡培养可以在固体培养基上直接完成，是两类较好的实验材料。

六、实验步骤

（一）操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，尽量做到不带菌。

（二）将事先用自来水洗净的胡萝卜贮藏根切成一定的大小。

（三）在超净工作台中，无菌操作，用70%乙醇洗涤30秒，再用0.1%升汞灭菌5分钟，最后用无菌水清洗3-5次。

（四）削去外部，把剩余部分切成3mm×3mm×1.5mm大小方块。

（五）由小镊子，在无菌条件下，将组织小块放入盛有脱分化培养基的三角烧瓶中，每瓶放1-2块根组织块。

写明日期，组号，姓名。

（十一）20℃—25℃避光培养3—4星期后观察，记录实验结果。

七、作业

1、观察并记录接种的脱分化培养的组织有无污染？

原因是什么？

2、什么是愈伤组织？

它的作用是什么？

描述在实验中观察到的愈伤组织的状态。

八、实验要求

1、学生要分组参与实验准备，参加的小组负责在课堂上向全班报告实验准备情况。

2、课前写出预习报告，课前上交，方可参加实验，并准备课堂上的实验原理与实验基本步骤的提问。

3、携带必备的工具参加实验，如白大衣、教材等。

4、本次实验的作业可以在观察记录实验结果后一周内交。

5、实验中四人为一个小组，共同完成实验，每人至少接种一瓶材料。

实验预习报告格式要求

一、用学校统一印制的报告纸（或16开白纸）书写，不可打印。

二、要求书写的内容：

1、实验原理

2、实验目的

3、实验基本步骤（可简要写，也可用路线图表示）

实验报告格式要求

一、用学校统一印制的报告纸（或16开白纸）书写，不可打印。

二、绘图必须用铅笔完成，要求用生物绘图的基本方法完成。

三、要求书写的内容：

1、实验题目

2、实验材料

3、实验步骤（可简要写）

4、作业

5、