免疫组化非标记免疫酶法PAP.docx
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免疫组化非标记免疫酶法PAP
免疫组化-非标记免疫酶法(PAP)
非标记抗体酶法
由于酶标抗体存在一些缺点,例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性;②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后,与组织成分结合,可致背景染色等。
为此Sternberger等在酶标法的基础上,发展了非标记抗体酶法。
包括酶桥法(EnzymeBridgeMethod)和过氧化物酶抗过氧化物酶法(PeroxidaseAntiperoxidaseMethod,PAP法)。
现分述如下。
(一)酶桥法
1.基本原理 首先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体,然后使用第二抗体作桥,将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上,再将酶结合在抗酶抗体,经呈色显示抗原的分布。
在此过程中,任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合,避免了共价连结对抗体和酶活性的损害,提高方法的敏感性,且能节 省第一抗体的用量。
2.染色步骤主要程序如图4-4
能,1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[(福氏完全佐剂,含HRP3.3mg(RZ=3.0)];间隔2周第2次注射,背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg;再间隔2周,第3次注射,2mgHRP(溶于2ml生理盐水中),分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射,1周后采静脉血,检查效价。
再隔1周第4次加强注射(条件同第3次),一周后检查抗体效价,琼脂糖扩散法(HRP0.1mg/ml)为1:
128以上时,颈动脉取血,制备血清低温保存备用。
(2)制备PAP复合物:
离体条件下,使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。
在制备抗HRP血清时,HRP的纯度要高(RZ≥3),而制备PAP复合物时,HRP的质量要求不高,甚至可用酶的粗制品。
【步骤】
①取10.50ml抗HRP血清,加7.60ml含7.6mgHRP(1.0mg/ml)的水溶液。
②混匀,室温1h后,离心16000g4℃15min。
③0.9%NaCl(冷盐水)溶解沉淀,离心16000g4℃15min,重复4次。
④加15.3mlHRP水溶液(含HRP30.64mg),室温,持续搅拌。
⑤用1NHCl及0.1NHCl调pH至2.3,沉淀物全部溶解变清,立即用1N及0.1nNaOH调pH至7.2。
⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵,置0℃45min。
⑦离心35000g0℃15min,沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。
⑧用10.50ml水溶解沉淀,对透析液(48.6gNaCl,1.5NNaOOCCH330ml,3N(NH4)2SO430ml,水5.94L)透析,4℃离心,收集上清,加透析液使体积至10.50ml,分装低温保存。
PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应,在抗原稍过量时,所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物,仅残留少许游离的HRP,而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。
PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响,无论最初加入的抗原抗体过量与否,最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3:
2。
应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明:
PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400~430kD,由此可推算出酶与抗体之比为3:
2,即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构,3个角为HRP,另两个角为抗HRP抗体。
采用H2O2-DAB染色,电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构,直径平均21nm。
这种结构异常稳定。
据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108,在此可溶性复合物中,即使存在少量游离HRP,亦不影响其稳定性。
2.PAP染色原理及步骤
(1)原理:
与酶桥法相似,都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上,所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1,用PAP复合物代替,即第三步用PAP复合物孵育切片,故称PAP法。
PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG,所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。
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(2)染色步骤:
主要步骤与酶桥法相似,如图4-5。
①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法;切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。
②用过量的桥抗体孵育,作用同酶桥法。
图4-5 PAP法主要染色步骤
③用离体制得的PAP复合物(1:
30~300稀释)孵育1~1.5h(室温),使其被桥抗体连结在第一抗体上。
亦可用ALP抗ALP复合物代替。
④显色观察等同间接法。
3.PAP法的评价 PAP法应用比较广泛,特别是近几年,PAP、ABC等试剂盒商品化,在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。
其主要特征和注意事项如下:
(1)抗体活性高:
非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性,因为在所有的反应过程中,任何抗体均未被酶连结,避免了标记过程(共价键连结)对抗体活性的损害。
(2)灵敏度高:
灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。
从理论上讲,PAP法应该较间接法敏感2倍以上,因为酶标抗体法中,酶与抗体为1:
1标记,而PAP复合物含有3个HRP分子。
假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合,则被连结于抗原部位的酶分子数量不同,所以PAP法应较敏感。
我们知道组织切片抗原的含量是未知的,所以不能直接在切片上检测方法的敏感度;但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定,采用相邻切片染色,以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度,用信噪比(Signal/moise,S/N)表示。
据此,Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感20~25倍,可进一步稀释第一抗体,以节 省其用量。
但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。
笔者在实验中注意到,PAP显示阳性的抗原,相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应,而时间阴性时,PAP法亦为阴性。
其原因尚不清楚,可能与桥抗体和第一抗体结合时,“剩余”(游离)的Fab段少,PAP复合物被连结的相应减少有关。
另外,PAP复合物分子量较大(400KD),冰冻切片时,对组织穿透性远不如酶标抗体(分子量90~180kDa),所以不适于免疫电镜的标本制作。
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