转录组相关实验技术.docx

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转录组相关实验技术

实验七聚合酶链反响〔PCR〕技术体外扩增DNA

目的

1、学习PCR反响的根本原理和实验技术。

2、了解引物设计的一般要求。

原理

聚合酶链反响〔polymerasechainreaction，PCR〕是体外酶促合成DNA片段的一种技术。

利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。

PCR进展的根本条件：

⑴DNA模板〔在RT-PCR中模板是RNA〕；

⑵引物；

⑶dNTP〔dATP、dTTP、dGTP、dCTP〕

⑷TaqDNA聚合酶

PCR循环由三个步骤组成：

⑴变性使模板DNA解离成单链；

⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；

⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

引物设计：

要保证PCR反响能准确，特异，有效的对引物DNA进展扩增，通常引物设计要遵循以下原那么：

⑴引物长度：

15~25个核苷酸；

⑵CG含量为40%~60%；

⑶Tm值为55℃〔Tm=4〔C+G〕+2〔A+T〕计算；

⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；

⑸引物自身配对形成的茎环构造，茎的碱基对小于3，

⑹两条引物间配对碱基数小于5个。

由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。

本实验以实验一中提取的质粒DNA为模板，进展PCR扩增，大量得到目的DNA片段。

试剂与器材

一、试剂

1、TaqDNA聚合酶2、10×反响缓冲液〔含25mmolMgCl2〕

3、dNTP4、引物〔P1、P2〕

5、溴乙啶染色液（EB）：

10mg/ml溴乙啶。

注意：

该试剂具致癌作用，用时要小心。

6、点样缓冲液Loadingbuffer〔10×〕：

0.25%溴酚蓝，40%甘油。

二、器材

1、PCR扩增仪2、电泳仪3、台式离心机

4、紫外分析仪5、恒温水浴6、凝胶成像系统

操作步骤

一、PCR扩增

1、按下表参加试剂，并小心混匀。

模板为实验一中提取的质粒DNA。

试剂体积〔50ul〕

ddH2O35ul

10xbuffer5ul

10×dNTP5ul

PrimerP11ul

PrimerP21ul

模板2ul

Taq酶〔2.5U〕1.0ul

2、设置PCR程序：

94℃180s

94℃45s

35cycles:

55℃45s

72℃60s

72℃600s

3、运行PCR程序

二、PCR产物鉴定

反响完毕后，取20ulPCR产物进展1.2%琼脂糖电泳分析。

实验八RNA提取与纯化

一、目的

掌握RNA提取的根本技术，了解RNA提取过程中的各种本卷须知。

二、原理

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。

提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，参加乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。

那么如何区分DNA和RNA分开？

DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进展区分。

另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。

RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。

所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6h以上。

所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。

配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反响，应防止用DEPC处理。

另外操作过程中应戴手套。

判断RNA的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性〔是否被降解〕。

RNA的纯度可以通过分光光度计进展测定的A260／A280值来判断。

RNA的完整性主要通过电泳分析来说明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带〔如果有DNA污染那么在RNA后会发现基因组DNA对应的条带〕。

RNA电泳系统也要严格对RNA酶进展处理。

如果用普通琼脂糖凝胶电泳，那么用尽量减少电泳时间。

三、试剂与器材

〔一〕试剂

1、暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3h

2、DEPC

3、DEPC处理的ddH2O

4、RNA提取液：

〔每1000毫升中含有〕

Tris6.06克（最终浓度为50mM）

LiCl6.03克（LiCl-H2O9.06克）（最终浓度为150mM）

EDTA〔0.5M〕10毫升（最终浓度为5mM）

SDS50克（最终浓度为5%）

5、8MLiCl：

33.92克LiCl溶于100mlDEPC处理的ddH2O

6、水饱和酚

7、氯仿

8、0.5MNaCl

9、溴乙啶（EB）：

10mg/ml溴乙啶。

注意：

该试剂具致癌作用，用时要小心。

10、点样缓冲液Loadingbuffer〔10×〕：

0.25%溴酚蓝，40%甘油。

三、器材

1、分光光度计2、电泳仪3、台式离心机

4、手提式紫外监测仪5、恒温水浴6、凝胶成像系统

四、操作步骤

1、取植物叶片1-3克，放在液氮中磨成粉末。

（可以多研磨一些，然后分装，小量提取试剂量可减至1／10）

2、液氮挥发完之前，倒入含有10毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。

3、立即参加10毫升的等体积〔酸性〕酚/氯仿，剧烈〔！

〕反复倒置混匀5至10min〔如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！

〕。

4、13000g×5min，吸管取上清〔注意防止吸取界面上的蛋白〕。

5、重复步骤3和4，三次左右〔注意观察界面上白色物质〕。

6、取上清，参加等体积的氯仿，反复倒置混匀2-5min。

7、13000g×5min。

8、取上清，参加1/3体积8M的LiCl〔即8MLiCl应占最后体积的25%〕，沉淀RNA，4℃过夜。

9、离心13000g×10min。

10、弃上清,保存沉淀〔此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作〕,参加70%无水乙醇+30%0.5MNaCl的混合液0.5毫升洗涤沉淀数分钟〔和缓地反复倒置混匀〕，离心〔13000g×2min〕。

重复洗涤沉淀数次。

11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。

12、用枪头吸去残留的液体，真空枯燥2min。

13、参加200ulDEPC处理过的水溶解RNA。

14、取用5ul电泳检测RNA完整性,用TEB缓冲液,200V×20-30min。

15、取5ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度，A260nm/A280nm应在2.0左右。

16、将RNA分装,放在-70℃长期保存备用.

辅助方案：

试剂盒提取法〔Trizol〕

〔一〕试剂：

1.TtizolReagent2.氯仿3.异丙醇4.70%无水乙醇

5.DEPC

〔二〕器材：

1、研钵2、离心机

〔三〕实验步骤

1、称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。

2、参加1mlTrizolReagent，15～30℃×5min。

3、参加0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，15～30℃×3min。

4、冷冻离心12000rpm×15min。

5、将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。

6、冷冻离心12000rpm×10min。

7、参加0.5ml70%乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500rpm×2min，除去乙醇。

8、参加30ulDEPC处理过的ddH2O溶解RNA。

实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA

目的

学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

原理

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。

如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。

逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo〔dT〕的引导下合成mRNA互补的DNA〔plementalDNA〕，再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。

这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

试剂与器材

一、试剂

1、RNA模板2、cDNA引物3、反转录缓冲液

4、dNTP5、AMV反转录酶

6、RNA抑制剂〔RNasin〕7、Taq酶

8、10×PCR缓冲溶液9、引物〔P1、P2〕

二、器材

1、PCR扩增仪2、电泳仪3、台式离心机4、恒温水浴

5、紫外分析仪6、微量移液器

操作步骤

一、RNA的反转录

1、在小管中依次参加

5ulRNA

6ulDEPCH2O

混合后,65℃×5min（破坏二级构造）.

2、置于冰浴5min.

3、在管中依次参加:

（反响体系为20ul）

RTbuffer（5×）4ul

RNasin0.5ul

dNTP（10mM）2ul

OligoT17A〔G／C〕〔50-100uM〕1ul

AMV反转录酶1ul

置于42℃×1h。

4、70℃×5min〔使酶失活，可省略〕。

5、参加100ulddH2O（从总RNA开场制备）或1000ulddH2O〔从mRNA开场制备〕。

6、置于-20℃保存备用.

二、PCR扩增DNA

在灭菌的0.5mlPCR管中，依次参加

20μlcDNA

10μl10×PCRbuffer

5μldNTP

2μlRT引物I

2μlRT引物II

1μlTaqDNA聚合酶

加ddH2O补足50μl，混匀。

PCR程序：

94℃3min

95℃30s

35cycles:

55℃60s

72℃90s

72℃10min

三、PCR产物的鉴定

取20ulPCR产物进展1.2%琼脂糖电泳分析。