蛋白A亲和层析介质.docx
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蛋白A亲和层析介质
蛋白A亲和层析介质
(征求意见稿)
编制说明
《蛋白A亲和层析介质》
国家标准起草工作小组
二〇一九年一月
《蛋白A亲和层析介质》国家标准
编制说明
(征求意见稿)
一、任务来源
本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》,项目编号“2016YFF0202304”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口,定于2019年完成。
本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。
二、目的和意义
单抗药物对生产制造纯化工艺的效能和成本要求非常高,单抗分离纯化成本占其生产总成本的50-70%,其中蛋白A亲和层析介质是其生产的关键原材料之一,其性质和成本将决定单抗产品的最终生产成本、纯度和收率。
目前,80%以上的抗体纯化使用蛋白A亲和层析。
蛋白A亲和层析介质的载量、稳定性等是单抗纯化选择介质时的首要考虑。
蛋白A来源于金黄色葡萄球菌的一个株系,它含有5个可以和抗体分子Fc段特异性结合的结构域。
将蛋白A偶联至基质上(以琼脂糖基质为主)制成蛋白A亲和层析介质,可以与抗体特异性结合,选择性极高,一步亲和层析可达到95%以上的纯度。
蛋白A亲和层析因特异性强、操作简单、处理量大等优势,已成为抗体药物研发和生产阶段的核心纯化步骤。
蛋白A亲和层析介质作为单抗药物生产过程的关键分离材料之一,其性质和成本决定单抗产品的最终纯度、收率和生产成本。
我国当前尚未建立相应的国家及行业标准,国内市场上的蛋白A亲和层析介质产品质量良莠不齐,缺乏产品生产、检验和质量规范。
这在一定程度上限制了我国蛋白A亲和层析介质的发展及相关层析技术的应用,更阻碍了国内单抗产业的发展水平。
因此建立蛋白A亲和层析分离介质的国家标准,对于规范蛋白A亲和介质行业,推进层析技术应用,以及促进单抗产业发展,均具有重要的理论和现实意义。
目前,蛋白A亲和层析介质的性能参数测定方法多种多样,以动态载量测定方法为例,一种是将介质装柱并连在层析仪上,平衡,上样抗体,待流出液浓度与上样浓度相等时上样结束,依次经淋洗、洗脱,收集洗脱液,测定洗脱液体积及洗脱液浓度,计算洗脱载量。
另一种则是将介质装柱并连接到层析仪上,平衡、上样抗体,根据穿透曲线,以5%穿透处介质对抗体的吸附量进行载量计算。
还有则是在第二种方法的基础上按照10%穿透处介质对抗体的吸附量进行载量计算。
这三种方法测定同一介质样品得到的结果均有明显差异。
由于测定方法不同产生的类似问题也出现在其他参数测定上。
这些差异对于介质的应用存在诸多不便。
因此,建立蛋白A亲和层析介质国家标准,能够规范蛋白A层析介质的生产与检验过程,促进介质和相关层析技术在单抗生产等领域的应用,并对推动我国层析介质在世界范围内的应用均具有重要意义。
三、标准制定原则
(一)标准编制原则
蛋白A亲和层析介质属于生物体系分离材料,重点围绕介质的主要性能要求,设定相应技术内容。
在确保产品质量的基础上,充分体现产品的特点。
(二)标准制订主要依据
1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分:
标准的结构和编写规则》的有关要求。
2、标准编写内容参考我国与化学品相关的法规、标准,包括GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备、GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备等等。
四、标准主要技术内容
(一)标准适用范围的说明
本标准规定了蛋白A亲和层析介质的质量要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存的标准。
本标准适用于骨架为琼脂糖微球的分离介质的生产与检测。
(二)内容提要
蛋白A亲和层析介质的主要理化性质包括外观、粒径及分布、耐受压力强度测试、配基密度、动态载量、微生物污染等。
2.1外观
2.1.1方法提要
采用光学显微镜观测蛋白A亲和层析介质的外观形貌。
光学显微镜使用普及率高,可观测范围一般在数微米到数百微米之间,样品处理过程和观测过程都简便易行,观测结果清晰、重复性好,是常用的材料外观表征方法之一[1]。
蛋白A亲和层析介质的外观形貌主要包括球形和透明性,其尺寸大小在光学显微镜的测量范围内[2]。
2.1.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中三级要求。
光学显微镜。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.10MPa。
2.1.3样品前处理
用量筒量取5mL蛋白A亲和层析介质,置于50mL砂芯漏斗中。
用三级水清洗5次,每次2min,抽干5min。
将洗净的蛋白A亲和层析介质置于烧杯中,介质上应有2cm的三级水。
混匀后得到蛋白A亲和层析介质与水的混合体系。
2.1.4样品观测
用塑料吸管吸取1mL蛋白A亲和层析介质与水的混合体系置于载玻片上,调整显微镜放大倍数。
以视野里80%以上面积均为介质为标准,用塑料吸管增减载玻片上的微球,最后用盖玻片压上。
调节光学显微镜焦距,使视野中的影像清晰。
拍摄蛋白A亲和层析介质照片并保存。
图1蛋白A亲和层析介质光学显微镜照片
2.1.5方法验证
为了确定检验方法,标准起草单位已委托三家单位对方法进行复核验证。
2.2粒径及其分布
2.2.1方法提要
粒径和粒径分布是微球最基本的性质参数,对流速和分辨率均有重要影响[1]。
蛋白A亲和层析介质是球形颗粒,其大小用直径来量度。
微球用于生化分离介质时,其粒径通常较小。
常见的蛋白A亲和层析介质粒径范围是45-165μm,平均粒径是90μm[3]。
采用激光粒度分析仪测定蛋白A亲和层析介质的粒径方法十分简便[1]。
平均粒径及其粒径分布的定义如下:
其中di为单个介质的粒径,dn为所统计的一定数量介质颗粒的平均值,N为所统计的介质颗粒的数目。
2.2.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中三级要求。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.1MPa。
2.2.3样品前处理
方法同2.1.3。
2.2.4样品测定
设置测量颗粒类型为通用型,分散剂类型为水,分析模式为单峰模式,添加样品进行测定。
通过激光粒度仪的检测结果包括平均粒径值及其分布图。
以45-165μm为例,根据粒径分布(如图1中表格)按公式
(1)计算该粒径范围内微球数量所占百分比。
……………………………………
(1)
式中:
W粒径——45-165μm粒径范围内微球数量所占百分比,单位是%;
W1,W2,……Wx——符合45-165μm范围的各粒径范围百分比,例如图2中52.481μm-60.256μm的球所占百分比为2.85%。
体积平均粒径按公式
(2)计算:
……………………………………
(2)
图2蛋白A亲和层析介质粒径分布图
2.2.5允许差
同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的5%。
表1精密度试验(n=3)
试验序号
平均粒径值(μm)
W粒径
1
87.947
100%
2
87.953
100%
3
87.968
100%
x
87.956
100%
s
0.0088
0
RSD(%)
0.01
0
2.2.6方法验证
为了确定检验方法,标准起草单位已委托三家单位对方法进行复核验证。
2.3耐受压力强度测试
2.3.1方法提要
层析过程中,易于装柱、流速较快、有利于工业规模生产等,这些都对介质结构提出一定要求。
介质骨架的刚性直接影响其水力学通透性,良好的机械强度保证介质在流动相的静压力作用下不会变形[4]。
通常用压力-流速曲线表示流速与柱压之间的关系[5]。
该曲线以柱压为横坐标,柱流速为纵坐标,反映了介质的机械强度。
机械强度较高的介质耐压性能好,在较高压力下仍能保持较快流速,从而大大节省了层析操作时间,层析效率得以提高。
过软的基质对液体阻力大,影响流速,延长层析操作时间。
层析系统操作简便,自动化程度高,流速和压力设定准确,测定重复性好,是测定介质压力-流速曲线的通用方法。
2.3.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中三级要求。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.10MPa。
中低压层析系统。
2.3.3样品前处理
方法同2.1.3。
2.3.4样品测定
装柱:
将蛋白A亲和层析介质与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定(Φ1.60cm×10.00cm),柱子上端充满水。
打开柱子入口,连续向柱中通入三级水(10个柱体积),保持床层稳定。
测定:
将层析柱连入中低压层析系统。
测定时,从零开始设定一定流速Vx(mL/min),保持该流速5min后,记录此时柱压Px(MPa)。
继续增加流速,并测定相应流速下的柱压。
直到压力达到0.10Mpa为止。
2.3.5结果表示
按公式(3)计算线速度。
以线速度(V)与压力(Px)之间的关系作图,由图读取最大流速(如图2)。
…………………………………………(3)
式中:
V——线速度,单位为厘米每小时cm/h;
Vx——流速,单位为毫升每分钟mL/min;
S——层析柱截面积,单位为平方厘米cm2。
图3蛋白A亲和层析介质压力-流速曲线
2.3.6允许差
同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的10%。
表2精密度试验(n=3)
试验序号
最大流速值(cm/h)
1
390
2
420
3
420
x
410
s
14.1
RSD(%)
3.44
2.3.7方法验证
为了确定检验方法,标准起草单位已委托三家单位对方法进行复核验证。
2.4配基密度
2.4.1方法提要
亲和层析可以从复杂的多组分混合物中有选择性地吸附目标蛋白质,一次纯化就可以达到电泳纯。
正由于亲和配基的特异性吸附的能力,也就造成了亲和层析介质的价格昂贵。
制备性能稳定的亲和层析介质,其关键之处就是要合理的控制配基密度,配基指的是连接在介质骨架上起吸附作用的的分子,如酶、染料、金属离子等[6]。
对于蛋白A亲和层析介质,其配基就是蛋白A。
合理的配基密度不但是亲和介质的载量达标的先决条件,也是控制亲和介质成本的必要手段。
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收,再以标准盐酸滴定,就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。
利用此法,我们可以简单便捷地对蛋白A亲和层析介质的配基密度进行标定,从而可以更好的控制蛋白A亲和层析介质的性能。
2.4.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中三级要求。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.10MPa。
中低压层析系统。
2.4.3样品前处理
方法同2.1.3。
2.4.4样品测定
2.4.4.1蛋白A标准曲线建立
准确称量10.0mg蛋白A,溶于1mL水中。
配制10mg/mL、6mg/mL、3mg/mL、1.25mg/mL蛋白A标准溶液。
准确量取1mL蛋白A标准溶液,将溶液无损失地转移到100mL凯氏烧瓶中,加入50mg硒粉和5mL浓硫酸。
置于电炉上加热。
先用小火慢慢加热至液体呈透明淡绿色(约2h),然后改用大火继续加热30min,当液体澄清透明后停止加热并冷却。
凯氏定氮仪进行测定:
加入10mL40%的氢氧化钠溶液,蒸气浴进行反应。
用25mL含2%硼酸的溶液(加入5-6滴甲基红-溴甲酚绿指示剂,浅紫色)收集馏出液,冷凝器的出液口浸于硼酸溶液液面以下。
硼酸溶液的体积达到45mL时冷凝器的出液口离开液面,用去离子水冲洗冷凝器的出液口,至最终体积为50mL时停止收集。
用0.05M的盐酸标准溶液滴定上述硼酸溶液至灰色或蓝紫色为终点,并记录消耗盐酸标准溶液的体积。
以消耗盐酸标准溶液的体积和对应蛋白A的质量建立线型关系得到标准曲线。
图4蛋白A标准曲线
拟合得到蛋白A标准曲线:
y=0.1187x-0.0851,R²=0.9948。
2.4.4.2配基密度测定
准确称取1.00g介质样品,移入干燥的100mL凯氏烧瓶中。
后续操作按照2.4.4.1进行。
同时取1.00g空白介质进行上述操作,做空白对照。
2.4.5允许差
同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的5%。
表3精密度试验(n=3)
试验序号
配基密度(mg/mL)
1
7.66
2
7.60
3
6.94
x
7.40
s
0.3245
RSD(%)
4.38
2.4.6方法验证
为了确定检验方法,标准起草单位已委托三家单位对方法进行复核验证。
2.5动态载量
2.5.1方法提要
亲和介质的载量是评价介质性能的最重要因素之一。
指亲和层析介质最多可以吸附上的目标蛋白的量。
亲和介质的载量主要由两类相关的的参数决定:
1.正确选择基质、间隔分子和配基,使被吸附的蛋白与配基的相互作用最佳化;2.决定吸附载量的各种动力学因素如流速、平衡时间和吸附方式。
测定方法一般采用前沿分析法。
将一定浓度的目标蛋白样品持续的加到亲和介质上,并监测其流出情况。
当柱床吸附饱和时,流出液和样品溶液为同一浓度[7]。
再通过改变缓冲液的组成,pH、离子浓度、或温度等,将新的缓冲液注入柱中,遍能有效的洗脱吸附的蛋白质。
一般通过测定洗脱下的蛋白质的量,并认为其为该介质的载量。
另一种则是将介质装柱并连接到层析仪上,平衡、上样抗体,根据穿透曲线,以5%穿透处介质对抗体的吸附量进行载量计算。
还有则是在第二种方法的基础上按照10%穿透处介质对抗体的吸附量进行载量计算。
本标准采用10%穿透法进行载量测定,主要耗时短,样品损耗低,与真实载量接近,且测定重复性好,是测定蛋白A介质动态载量的最优方法。
2.5.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中三级要求。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.10MPa。
中低压层析系统。
2.5.3样品前处理
方法同2.1.3。
2.5.4样品测定
将层析柱连在层析系统中,对载量测定过程进行监控。
动态结合载量用10%临界值表示,检测280nm处吸收值。
测量并记录样品hIgG的100%UV信号,包括不结合到介质上的IgG亚类的紫外吸收。
用BufferA以2ml/min的流速至紫外基线平衡;以保留时间为5min的流速上样,待流穿曲线中hIgG的UV信号浓度为10%的样品浓度(UV信号)时上样结束,记录上样体积。
上样结束后用BufferA以2ml/min的流速平衡紫外信号至基线;用BufferB以2ml/min的流速进行洗脱。
计算动态结合载量。
图6是蛋白A亲和层析介质载量测定层析谱图。
图5蛋白A亲和层析介质载量测定层析谱图
2.5.5结果表示
以柱出口蛋白浓度C与入口蛋白浓度C0之比值C/C0与流出液体积作图,即介质的穿透曲线。
以柱出口蛋白浓度C达到入口蛋白浓度C0的10%时,介质的吸附容量为介质的动态载量,根据公式(4)计算:
·························(4)
式中:
Q10%——介质的动态载量,单位为毫克每毫升mg/ml;
C0——蛋白起始浓度,单位为毫克每毫升mg/mL;
V1——柱出口蛋白浓度C达到入口蛋白浓度C0的10%时流出液体积,单位为毫升mL;
V0——管路的死体积,单位为毫升mL;
Vgel——介质体积,单位为毫升mL。
2.5.6允许差
同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的10%。
表4精密度试验(n=3)
试验序号
动态载量(mghIgG/mL介质)
1
41.28
2
40.32
3
41.08
x
40.89
s
0.41
RSD(%)
1.01
2.5.7方法验证
为了确定检验方法,标准起草单位已委托三家单位对方法进行复核验证。
2.6微生物污染
2.6.1方法提要
微生物对分离介质的污染,不仅影响介质本身的质量,更严重的是它会在层析过程中影响生物制品的质量,进而对患者的健康和安全造成危害。
因此,将分离介质的微生物污染情况作为产品的一个质量指标,以防止和控制微生物对分离介质的污染,这对提高分离介质的质量和保证其使用安全性都具有十分重要的意义。
通常以介质在培养基中恒温培养一段时间繁殖形成的菌体数目进行评价。
其中,由单个细菌(或其他微生物)、细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度,形成肉眼可见的子细胞群落,定义为菌落。
在活菌培养计数时,由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落,成为菌落形成单位(Colony-FormingUnits,简称CFU),以其表达活菌的数量,即微生物污染情况。
2.6.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中三级要求。
胰蛋白胨大豆琼脂。
恒温箱(±0.5℃)。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.1MPa。
旋涡混合器。
2.6.3样品前处理
(1)方法同2.1.3。
(2)在空培养皿底部标记样品名称。
按照(GBT5475-2013离子交换树脂取样方法)直接从产品中抽取5mL蛋白A亲和层析介质样品,置于50mL砂芯漏斗中抽干5min。
取1mL抽干介质,加入1mL三级水,采用旋涡混合器混匀样品。
将含有30mL胰蛋白胨大豆琼脂培养基的锥形瓶进行高温灭菌(121°C,20min),待培养基冷却到40°C时,用微量移液器吸取1mL混匀后的样品加入到该锥形瓶中,缓缓混合,把混合物倒入培养皿中,盖好上盖。
2.6.4样品测定
凝固混合物:
在室温下使混合物凝固。
孵育:
把培养皿置于恒温箱中孵育。
在孵育期间培养皿需要倒置,在35℃中放置5天。
2.6.5结果表示
孵育期后检查培养皿。
计数菌落形成单位数(CFU),估计每毫升样品中微生物的数量。
图6蛋白A亲和层析介质菌落生长情况实物图
2.6.6允许差
同一试样三次测定结果之差,应不超过5。
表5精密度试验(n=3)
试验序号
菌落形成单位数(CFU)
1
0
2
0
3
0
2.6.7方法验证
为了确定检验方法,标准起草单位已委托三家单位对方法进行复核验证。
2.7化学稳定性
2.7.1方法提要
层析过程中分离介质的化学结构直接影响选择性和分离效果等,所以对介质的化学稳定性即骨架结构有严格的要求。
稳定的化学性质有助于使用者在层析和贮存过程中选择更广泛的实验条件。
对于蛋白A亲和层析介质来说,骨架结构的降解、配基的脱落等这些结构方面的不稳定性,不但影响介质的使用寿命,还会对目标产物的纯度产生致命的影响[9-11]。
以常见分离体系的溶液pH为评价范围,采取恒温加速实验方式,对蛋白A亲和层析介质开展贮存实验,以骨架降解主要产物即羟甲基糠醛的绝对质量及相对质量百分比为评价指标,对介质在这些pH范围内溶液中的稳定性情况进行测定。
其中,羟甲基糠醛的检测方法参考国标GB/T18932.18-2003《蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法液相色谱法——紫外检测法》和中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4675.8-2016《出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定液相色谱法》进行。
2.7.2试剂和材料
实验用水应符合GB/T6682-1992中一级要求。
恒温箱(±0.5℃)。
砂芯漏斗为G3(4.5-9μm)。
真空泵极限真空0.1MPa。
旋转蒸发仪。
高效液相色谱仪(配有紫外检测器)。
分析天平精度0.1mg。
容量瓶100mL和1000mL。
注射器10mL。
过滤膜0.45μm。
甲醇系色谱纯。
羟甲基糠醛纯度≥99%。
盐酸、硼酸、氢氧化钠均为分析纯。
2.7.3标准溶液配制
标准储备溶液:
准确称取适量的羟甲基糠醛标准物质于100mL容量瓶,用10mL甲醇溶解,定容,配成0.20mg/mL的标准储备液。
此溶液可在温度低于4℃冰箱中冷藏保存两个月。
标准工作溶液:
分别吸取适量的羟甲基糠醛标准储备溶液至100mL容量瓶中,用10%甲醇溶液稀释至刻度,配成0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.10μg/mL,0.20μg/mL,1.0μg/mL,2.0μg/mL,4.0μg/mL,6.0μg/mL,10μg/mL标准工作溶液。
当天新鲜配制。
2.7.4样品前处理
方法同2.1.3。
2.7.5样品贮存加速实验
取若干份1.00g抽干白球置于带盖玻璃试管内。
将上述pH3、pH13的溶液各10mL分别置于各试管内,平行实验三次。
样品管在40°C条件下培养7天。
7天后,上层清液被转移到干净的试管内。
2.7.6上机前样品处理
1)样品处理方法的确定
琼脂糖凝胶的降解方法主要有化学降解、物理降解和酶降解,其中酸降解属于化学降解。
相比于其他降解方法,酸降解目前仍是应用最广泛的方法,该方法相对简单、成本低,可使用的酸包括固态酸、柠檬酸、盐酸、硫酸和醋酸等。
对于蛋白A亲和层析介质来说,由于交联作用,凝胶骨架较为稳定,所以采用浓盐酸或浓硫酸提高降解效率。
2)样品处理
上层清液经旋转蒸发(60℃,50转/分),定容至2mL,加入等体积12M盐酸,100℃水解1h。
定容至5mL。
另取1.00g抽干白球,加入4mL6M盐酸,100℃水解1h。
定容至5mL。
用0.45μm的滤膜过滤,滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。
2.7.7色谱测定
1)色谱条件的确定
羟甲基糠醛的测定方法有比色法、紫外分光光度法和液相色谱法。
其中,液相色谱法已经作为国标成为测定羟甲基糠醛的主要方法。
与其他两种方法相比,液相色谱法受干扰小,结果更为准确。
色谱柱和色谱条件都是按照液相色谱实验中最常见的操作条件进行选择,即色谱柱选择DiamonsilC185μm,250mm×4.6mm(i.d.)或相当者,流动相是10%甲醇水溶液(甲醇:
水=10:
90)。
流速1.0mL/min。
检测波长285nm。
柱温30℃。
进样量10μL。
2)标准曲线的绘制
在上述色谱条件下对标准工作溶液进行检测,以保留时间对样品进行定性,工作曲线外标法对样品进行定量。
测定标准工作溶液在上述色谱条件下的峰面积,以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线,羟甲基糠醛的参考保留时间为9.79-10.40min范围内,保留时间随样品浓度变化而变化浓度越低保留时间越小。
羟甲基糠醛标准物质色谱图见图7。
a
b
图7羟甲基糠醛标准物质色谱图
2)液相色谱测定
在上述色谱条件下对未知样品进行检测,测定样品的峰面积,用标准工作曲线对样品进行定量。
样品溶液中羟甲基糠醛的响应值应在仪器的线性范围内。
在上述色谱条件下,羟甲基糠醛的参考保留时间约为9.7-10.25min。
含有羟甲基糠醛的样品色谱图见图8。
图8含有羟甲基糠醛的样品色谱图
3)空白试验
除不加样品试液外,均按上述步骤进行。
2.7.8结果表示
上清液中的羟甲基糠醛的含量按下式计算获得,计算结果应扣除空白值。
…………………………………………(6)
式中:
X——不同pH试样中羟甲基糠醛的含量,单位是毫克每升(mg/L);
c——从工作曲线求得的试样溶液中羟甲基糠醛的含量,单位是毫克每升(mg/L);
V——试样最终的定容体积,单位为毫升(mL);
V0——试样的取样体积,单位是
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