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培养基模拟生产验证方案

培养基模拟生产验证

1概述：

对无菌灌装过程进行胰酪胨大豆肉汤培养基模拟灌装试验，通过对其污染率的测试，来确认预充式无菌灌装过程和各种规程防止微生物污染的水平能达到可接受的合格标准。

2目的与范围：

2.1无菌生产环境、人员消毒卫生状况与产品无菌保证的验证。

2.2用棉球擦拭的方法验证设备设施清洁消毒效果。

2.3验证的试验过程中监测底塞、卡式瓶的无菌性，使之始终符合卡式瓶生产工艺要求。

2.4验证除菌过滤的可靠性，保证生产出合格的中间体半成品。

2.5验证物料转移过程中物料的无菌性，使之满足卡式瓶生产工艺需要。

2.6模拟无菌灌装试验来考察灌装操作过程微生物的污染率不大于0.1%，进而证明灌装工艺条件符合无菌灌装的工艺要求。

2.7通过轧盖密封后瓶内抽真空进行气密性测试，证明与轧盖相关的工艺条件符合卡式瓶生产工艺要求。

3职责：

3.1相关生产人员必须依照本规程进行生产操作。

3.2生产部门负责人及QA负责指导与监查本文件的执行。

3.3文件的修定和定期审核应由生产部门负责人员和QA负责。

3.4所有参与本验证过程的生产人员都必须依照本方案进行生产操作。

3.5验证过程应严格按照规定的内容进行，若因特殊原因确实需要变更时，应填写验证方案变更申请及批准书（附表1），报验证委员会批准。

4参考文献：

4.1Validationofasepticfillingforsolutiondrugproduct

4.2药品生产验证指南（2003版）

5设备及仪器：

序号

设备或仪器名称

使用数量

用途

1

64kg磅秤

1

秤量体积

2

6kg、3kg天平

1

秤量培养基

3

卡式瓶分装机、西林瓶分装机

1

分装培养基

4

蒸汽灭菌柜

1

灭菌

5

卡式瓶洗瓶机、西林瓶洗瓶机

1

洗瓶

6

卡式瓶和西林瓶隧道灭菌机

1

消毒

7

胶塞清洗机

1

烘干、消毒

8

50L搅拌桶

2

盛装培养基

9

搅拌棒

1

搅拌

10

配制罐1

1

配制

11

配制罐2

1

配制

12

套筒过滤器

1

过滤

13

蠕动泵

1

泵液体

14

20L不锈钢桶

2

容器

15

30L不锈钢桶

3

容器

16

2L烧杯

2

容器

17

10L不锈钢桶

2

容器

6物料

序号

物料名称

1

注射用水

2

蒸馏水

3

管制瓶、卡式瓶

4

胶塞

5

铝盖

6

胰酪胨大豆肉汤

7

75%乙醇

7验证内容

7.1判断标准

产品无菌性的可信限：

95%

产品允许污染的概率：

警戒限为＜0.05%，可信限为＞0.1%

7.2培养基配制、灭菌和过滤：

7.2.1按30g胰酪胨大豆培养基溶于1L蒸馏水的比例配制适量的培养基溶液，搅拌并加热溶解或直接量取70℃以上的蒸馏水，搅拌溶解后，，将盛放培养基的桶在蒸汽灭菌柜内121℃灭菌15分钟，待灭菌后自然冷却

7.2.2配制用于验证分装生产线的无菌性的培养基溶液体积应满足灌装3000支以上的量（一般灌装5000支左右）。

7.2.3冷却后用已灭菌的0.22um的套筒过滤器过滤于已灭菌的相应容量的不锈钢桶中。

注：

过滤过程应遵守无菌操作。

7.3培养基无菌性试验：

将用于模拟灌装的胰酪大豆培养基另外用50ml试管配制4管（20ml/管），在121℃灭菌15分钟，盖塞、封口后将其中2管在20～25℃培养7天，另外2管在30～35℃培养7天。

7天内若各试管中应无任何微生物生长，则判断合格。

结果填于附表2

7.4培养基微生物生长性能试验：

将配制好的灭菌培养基分装于10支50ml试管中（20ml/管），在其中４支管内接种＜１００ＣＦＵ的枯草杆菌，和1支不接种枯草杆菌的TSB试管（空白对照）同时在30～35℃下培养7天，在另４支试管内接种＜１００ＣＦＵ的白色念珠菌，和1支不接种白色念珠菌的ＴＳＢ试管（空白对照）同时在20～25℃培养７天，培养过程中每天观察微生物生长情况，七天内若50%以上接种的各试管的培养基应出现明显的所接种的微生物的生长，空白试验无菌生长，则判断合格。

结果填于附表3。

7.5无菌灌装试验：

7.5.1无菌灌装所用的瓶和塞塞经灭菌处理后，进行模拟灌装、轧盖。

每瓶和托盘都需标号，每盘上记录起始时间和结束时间。

整个过程应严格遵守相应的无菌灌装生产的标准操作规程。

模拟灌装生产的全部样品先在20～25℃培养７天，再在30～35℃下培养7天，一半倒置培养，一半正立培养。

培养过程中应每天观察微生物生长情况，若发现污染应明确记录瓶号、瓶数。

7.5.2阴性对照：

灌装过程中随机抽取2瓶不进行设备灌装直接手动加底塞、灌装培养基、封口，与试验样品同条件培养作为阴性对照。

。

7.5.3随意地取出8支灌有培养基的灌装瓶，向挑选出来的4支瓶内逐个注入0.1ml的枯草杆菌混悬液（每0.1ml中CFU少于100个），在30～35℃下培养7天，向挑选出来的另4支瓶内注入白色念珠菌混悬液（每0.1ml中CFU少于100个），在20～25℃培养７天。

如果在7天内，50%以上接种卡式瓶的培养基里都出现繁殖现象，则判为合格。

对瓶内的繁殖情况要进行目检，对污染的卡式瓶要点清数量（如有污染菌的话）。

污染了的卡式瓶必须仔细检查是否有瓶、塞、盖的损坏情况。

7.5.4试验结果评价

评价无菌模拟灌装试验结果的主要指标之一是微生物污染率，其计算方法如下：

污染率水平=[微生物生长的瓶数/（总分装瓶数-破损瓶数）]×100%

如果在14天的培养期内，其污染率大于0.1%，则应立即停止生产，调查污染产生的原因应检查铝盖、底塞的密封情况，若有破损应记录并检查其破损原因。

原因找到后立即重复进行无菌灌装模拟试验。

重复模拟灌装试验连续进行3次，2次均符合要求才可以认为此灌装工艺过程符合无菌灌装要求。

7.5.5灌装原始纪录作为附件，试验结果如附表4填写

7.6内包材的无菌试验

a）卡式瓶无菌试验：

试验前取灭菌后灌装前2支作无菌检查，试验过程中每灌大约1000瓶时在振料器上取2支作无菌检查，试验结束后在振料器上取2支作无菌检查。

b）底塞无菌试验：

底塞灭菌卸料时取2支作无菌检查，试验过程中每灌大约1000瓶时理塞盘上取2支作无菌检查，试验结束后在理塞盘上取2支作无菌检查。

c）复合铝盖无菌试验：

灭菌卸料时取2支作无菌检查，试验过程中每灌大约1000瓶时

在理复合盖盘上取2支作无菌检查，试验结束后在理复合盖盘上取2支作无菌检查。

d）判断标准：

阴性

e）按附表5填写结果。

7.7人员：

7.7.1参加人员：

7.7.2人员培训：

查阅操作人员个人培训档案，确认上岗操作人员已按培训计划进行基本生产技术培训,并进行人员净化消毒效果的检查。

c）判断标准：

①上岗操作人员已经接受了生产技术培训，②能按规程进行人员物料净化对设备设施正确清洗消毒③能规范操作，减少人员对环境造成污染。

d）人员培训确认结果按下表填写：

操作人员

培训情况

能否按规程进行人员物料净化对设备设施正确清洗消毒

能规范操作，减少人员对环境造成污染

结论

确认人/日期

7.7.3人员无菌监测：

人员更衣完毕用棉球擦拭法在手、前胸处取样作无菌性试验。

取样时间分别在试验前、试验过程中、试验结束用棉球擦拭法各取样1次检查操作人员上述部位细菌总数，按下表填写检验结果：

试验时间段

项目

手部

前胸

判断标准

结果判定

备注

检验人/日期

复核人/日期

试验前

细菌

细菌＜2个

霉菌＜1个

霉菌

试验中

细菌

霉菌

试验后

细菌

霉菌

7.8生产环境监测

7.8.1设备设施表面的微生物数量

7.8.1.1判断标准：

设备设施表面的微生物数量应符合相对应表面的微生物限度要求

名称

设备

设施

细菌/m3

细菌/m3

与产品接触的表面

无

无

其它表面

≤5

≤2

7.8.1.2试验方法：

用棉球擦拭法在试验开始前、中、后，在指定的取样点取样作无菌检查。

用灭菌的生理盐水润湿棉球，充分擦拭生产区最难清洁的部位，棉球取样面积为25cm2/个。

然后棉球放入带有灭菌的生理盐水的三角瓶中，充分振摇，然后进行微生物培养。

7.8.1.3将结果填入附表6

7.8.2HVAC状况监测

7.8.2.1试验方法：

序号

试验项目

试验方法

判断标准

1

温度与相对湿度

灌装生产开始前，并在灌装试验过程中每隔20分钟检查并记录一次，卡式瓶灌装间、配制间、存料称量间的温度，相对湿度。

温度：

18-26℃

相对湿度：

45-65%

2

房间相对压差

每隔20分钟在空气压差表上读取并记录一次各个房间的空气压差。

无菌生产区自甲醛消毒后至灌装生产结束之前，应始终对周围的其它生产区域保持相对正压。

3

层流罩下粒子计数

试验前（静态）在卡式瓶灌装间、配制间的垂直单向流区用粒子计数器测定空气中悬浮粒子数并记录。

层流罩下的空气质量应符合100级洁净空气要求。

≥0.5um的粒子：

≤3500/m3

≥5um的粒子：

无

4

无菌生产区室内粒

子计数

试验前（静态）在卡式瓶灌装、存料间用粒子计数器测定空气中悬浮粒子数，并记录。

无菌生产区室内空气质量应符合万级洁净空气要求

≥0.5um的粒子：

≤350000/m3

≥5um的粒子：

≤2000/m3

5

空气中微生物

按《洁净度标准操作规程》中规定的取样方法及检验方法在存料称量间、配制间、卡式瓶灌装间、无菌走廊试验前和试验过程中用沉降法测定空气中的微生物数。

空气中所含微生物的数量应符合相对应的区域要求。

沉降菌数（沉降法）/皿：

100级洁净区为≤1个；

10000级洁净区≤3个。

7.8.2.2将结果记录于附表7

7.9物料转移

7.9.1检查方法：

①工器具、洁服处理后的转移：

衣服、不锈钢桶、玻璃容器用棉球擦拭法在卸料、转移后取样作无菌检查。

用灭菌的生理盐水润湿棉球，充分擦拭，棉球取样面积为25cm2/个。

然后棉球放入带有灭菌的生理盐水的三角瓶中，充分振摇，然后进行微生物培养。

②灌装前药液的无菌转移：

将注射用水从配料桶周转到配制罐，此时从配制罐内取水样，无菌培养。

然后由无菌区周转到十万级再由十万级周转到卡式瓶的无菌区，此时从配制罐内取水样，无菌培养。

具体详见《培养基模拟生产验证报告》。

③内包材的无菌转移：

将灭菌后的底塞、卡式瓶在卸料、转移后取样作无菌检验，底塞外包装作擦拭试验。

④灌装用物料的无菌转移：

输送药液所用硅胶管和灌装针头在卸料转移后取样作无菌检查。

用0.9%无菌氯化钠溶液100mL冲洗内壁，收集冲洗液，（注：

用0.9%无菌氯化钠溶液100mL冲洗后的硅胶管和灌装针头，试验结束后再用注射用水冲洗。

）按无菌检查法中的薄膜过滤法检查。

7.9.2判断标准：

各种物料在卸料后及转移后均应无菌。

按附表8填写测试结果

8玻瓶的处理：

已灌装培养基的玻瓶在验证结束后全部销毁。

9缺欠项及纠正措施

9.1目的

建立缺欠项及采取的纠正措施，使验证规范化、标准化和程序化。

9.2内容

9.2.1按附表9格式总结缺欠项及纠正措施

9.2.2按附表10格式填写缺欠项纠正报告

10验证结果评定与结论

验证小组根据验证情况对验证结果进行综合评审，做出验证结论，按附表11填写验证总结报告，由验证委员会做出是否批准的决定及负责发放验证证书（见附表12）。

a）验证试验是否有遗漏？

b）验证实施过程中对验证方案有无修改？

修改原因，依据以及是否经过批准？

c）验证记录是否完整？

d）验证试验结果是否符合标准要求？

偏差及对偏差的说明是否合理？

是否需要进一步补充试验？

验证方案变更申请及批准书

附表1

验证方案名称：

方案编号：

验证方案预变更的项目：

变更的理由及依据：

修改后方案：

评估变更后对验证的影响：

□不会影响验证过程

□影响验证过程

□影响验证进度

起草人/日期：

部门经理/日期：

变更的审批：

□同意变更

□不同意变更

批准人/日期：

培养基无菌性试验结果

附表2

培养基瓶号

培养日期

培养温度（℃）

观察结果

观察日期

观察人

1

2

3

4

判断标准

应无任何微生物生长

结论

结论人/日期

培养基生物生长性能试验结果

附表3

类别

试管号

培养温度（℃）

观察结果

1

2

3

4

5

6

7

枯草杆菌

空白

1

2

3

4

白色

念珠菌

空白

1

2

3

4

观察日期

观察人

判断标准

空白试管应无菌生长，其它全部样品试管中均应有明显的微生物生长

结论

结论人/日期

灌装培养结果

附表4

培养基名称

灌装日期

灌装瓶数

观察日期/时间

培养温度（℃）

观察结果

观察人

阴性对照

阳性对照

灌装样品

判断标准：

可信限在95%的要求下，合格限：

污染率应＜0.1%；警戒限:

＞0.05%

计算公式：

污染率=95%可信限的控制上限/模拟分装的瓶数×100%

结论：

结论人/日期

试验过程监测记录表

附表5

样品数

取样位置

第一支

第二支

空白

结果

判定

备注

出瓶端的卡式瓶无菌试验（试验前）

直接培养法

出瓶端的卡式瓶无菌试验（试验过程中）

直接培养法

出瓶端的卡式瓶无菌试验（试验后）

直接培养法

桶内底塞的无菌试验（卸料时）

直接培养法

理塞盘上底塞的无菌试验（试验过程中）

直接培养法

理塞盘上底塞的无菌试验（试验后）

直接培养法

桶内复合盖的无菌试验（卸料时）

直接培养法

理盖盘上复合盖的无菌试验

（试验过程中）

直接培养法

理盖盘上复合盖的无菌试验（试验后）

直接培养法

检验员/日期

复核员/日期：

序号

擦拭位置

测试时间

判断标准

擦拭结果

备注

1

灌装机灌装工位台面

试验前

CFU≤5个

薄膜过滤法

试验过程中

CFU≤5个

试验后

CFU≤5个

2

灌装机上的理塞盘

试验后

阴性

直接培养法

3

灌装机底塞料斗

试验后

阴性

直接培养法

4

灌装机复合盖料斗

试验后

阴性

直接培养法

5

灌装机加塞定位圈

试验后

阴性

直接培养法

7

出料托盘

试验后

CFU≤2个

薄膜过滤法

8

灌装机传送转盘

试验后

CFU≤2个

薄膜过滤法

9

灌装机加塞推杆

试验后

阴性

直接培养法

10

灌装机复合盖轨道

试验后

阴性

直接培养法

11

灌装机复合盖锁紧

试验后

阴性

直接培养法

12

出瓶振荡盘

试验后

阴性

直接培养法

14

电子天平内表面

试验前

CFU≤2个

薄膜过滤法

15

转移桶

试验前

阴性

直接培养法

试验后

阴性

直接培养法

16

灌装间墙面

试验前

CFU≤5个

薄膜过滤法

试验后

CFU≤5个

17

灌装间地面

试验前

CFU≤7个

薄膜过滤法

试验后

CFU≤7个

检验员/日期

复核员/日期：

设备设施表面的微生物数量

附表6

HVAC监测记录

附表7-1

试验项目

房间名称

测试时间

测试结果

结果判定

温度（℃）

相对湿度

温度与相

对湿度

灌装间

配制间

存料称量间

空气中

相对压力

气闸与十万级

走廊的相对压差

灌装间与气闸

之间的相对压差

配制间与走廊

之间的相对压差

检验员/日期

复核员/日期：

尘埃粒子检测

试验项目

测试区域

测试位置

测试点数

测试结果

判定结果

≥0.5µm

≥5µm

层流罩下粒子计数

灌装间

百级层流罩内

配制间

百级层流罩内

无菌生产区室内粒子计数

灌装间层流罩外

万级区

配制间层流罩外

万级区

测试人/日期

复核人/日期

HVAC监测记录

（空气沉降菌）

附表7-2

测试区域

洁净级别

点数

结果

判定

测试人/日期

复核人/日期

灌装间（试验前）

万级

2

局部百级

12

灌装间（试验过程中）

万级

2

局部百级

12

配制间（试验前）

万级

2

局部百级

12

配制间（试验过程中）

万级

2

局部百级

12

存料间（试验前）

万级

2

存料间（试验过程中）

万级

2

更无菌外衣间（试验前）

万级

2

更无菌外衣间（试验过程中）

万级

2

物料转移无菌监测记录一

附表8-1

序号

擦拭位置

测试时间

判断标准

擦拭结果

备注

1

装衣服外袋①

卸料后

阴性

转移后

阴性

装衣服外袋②

卸料后

阴性

转移后

阴性

2

汤桶①

卸料后

阴性

转移后

阴性

汤桶②

卸料后

阴性

转移后

阴性

3

玻璃容器①

卸料后

阴性

转移后

阴性

玻璃容器②

卸料后

阴性

转移后

阴性

4

底塞外包装①

卸料后

阴性

转移后

阴性

底塞外包装②

卸料后

阴性

转移后

阴性

6

复合盖外包装①

卸料后

阴性

转移后

阴性

复合盖外包装②

卸料后

阴性

转移后

阴性

7

将周转罐转到无菌

配制间后取水样

阴性

由结晶罐周转到周转罐

内无菌水水样

阴性

推到无菌区灌装后取样

阴性

取结晶罐内水样

阴性

测试人/日期

复核人/日期

物料转移无菌监测记录表二

附表8-2

序号

样品名称

取样时间

细菌

霉菌

空白

结果

判定

测试人/日期

复核人/日期

1

硅胶管

卸料后

转移后

2

灌装针头

卸料后

转移后

3

底塞

卸料后

转移后

4

复合盖

卸料后

转移后

缺欠项及纠正措施报告

附表9

工艺名称

欠缺项目

纠正措施

总结人：

日期：

批准人：

日期：

欠缺项纠正报告

附表10

欠缺项目

纠正结果

总结:

结论

总结人:

日期

批准人：

日期：

验证总结

附表11

工艺名称

评定项目

评定结果

验证试验是否有遗漏？

□是/□否

验证实施过程中对验证方案有无修改？

□是/□否

修改原因，依据以及是否经过批准？

原因及依据：

是否经批准：

□是/□否

验证记录是否完整？

□是/□否

验证试验结果是否符合标准要求？

□是/□否

偏差及对偏差的说明是否合理？

□是/□否

是否需要进一步补充试验？

□是/□否

确定验证周期:

验证周期为：

验证小组成员：

验证总结：

总结人：

日期：

验证证书

附表12

工艺名称

验证报告审核结果

按照方案要求,该验证已经完成,经审核:

结果符合方案的要求,合格

结果不符合方案的要求,不合格

执行负责人:

日期:

审核人:

日期:

批准人:

日期:

分装系统培养基分装验证记录：

1.0物料单:

序号

物料名称

规格

厂家

领料量

领料人/时间

2.0设备：

序号

品名

状态

检查人/时间

磅秤

天平

洗瓶机

分装机

灭菌隧道

蒸汽灭菌柜

配制罐

平板过滤器

套筒过滤器

3.0器具：

序号

品名

状态

检查人/时间

1

不锈钢桶

2

搅拌棒

3

烧杯

4.0配料、灌装间的熏蒸消毒与监测：

熏蒸用的溶液：

体积：

熏蒸前的室