时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分.docx
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时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分
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时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分
时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析
EstablishmentandanalysisofanalyticsensitivityofhepatitisBvirusserummarkersbyTime-resolvedFluoroimmunoassay
谭玉华陈鲜美卢顺舵沈健
(广州市丰华生物工程有限公司,广东广州510730)
摘要对乙型肝炎表面抗原和表面抗体定量测定试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法)的分析灵敏度进行建立与分析,以便更好的指导临床诊断和进行流行病学研究。
通过实验研究,乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒和表面抗体定量检测试剂盒的检测低限分别为mL和mIU/mL,生物检测限分别为ng/mL和mIU/mL,功能灵敏度分别为ng/mL和mIU/mL,线性范围分别为ng/mL-300ng/mL和mIU/mL-1200mIU/mL,并达到中国药品生物制品检定所检定要求。
时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎病毒定量检测试剂盒具有灵敏度高,线性范围宽,特异性强的特点,已能有效应用于临床体外诊断和流行病学研究。
关键词时间分辨荧光免疫分析;乙型肝炎;标志物;分析灵敏
EstablishmentandanalysisofanalyticsensitivityofhepatitisBvirusserummarkersbyTime-resolvedFluoroimmunoassay
TANYu-hua,CHENXian-mei,LUShun-duo,etal.GuangzhouFenghuaBio-engineeringCo.,LTD,Guangzhou510730China
AbstractToestablishandanalysetheanalyticsensitivityforthequantificationkitsforhepatitisBvirus(HBV)surfaceantigen(HBsAg)andantibodytoHBsAg(anti-HBs),thekitsweremeasuredbyTime-resolvedFluoroimmunoassay(TRFIA),inordertothebetterinstructionclinicaldiagnosisandconductstheepidemiologyresearch.Throughthestudy,thelowerlimitofdetectionofthequantificationkitsforHBsAgandanti-HBsformLandmIU/mLrespectively,thebiologicallimitofdetectionisng/mLandmIU/mLrespectively,thefunctionsensitivityisng/mLandmIU/mLrespectively,thelinearscopeisng/mL-300ng/mLandmIU/mL-1200mIU/mLrespectively,andpassedtheexaminationoftheNationalInstituteforControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts.ThequantificationkitsforHBVserummarkersbyTRFIA,whichhasthehighsensitivity,thewidelinearscope,thegoodspecificity,couldhavetheeffecttouseintheclinicalinvitrodiagnosisandtheepidemiologyresearch.
KeywordsTime-resolvedFluoroimmunoassay;HepatitisBvirus;Marker;Analyticsensitivity
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的检出是乙型肝炎病毒(HBV)感染的金标准。
乙型肝炎病毒表面抗体(抗-HBs)是对HBV具有保护性的免疫指标,它的检出有助于乙型肝炎(简称:
乙肝)的预防与接种。
随着时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)在定量检测HBsAg和抗-HBs中的应用,对HBsAg和抗-HBs的分析灵敏度有了进一步提高,并且定量结果取代了定性报告,为临床诊断提供了更多的信息。
在实验室,对试剂盒和方法学有必要建立自己的可定量报告的生物检测限或对试剂盒和方法学说明的检测限进行确认[1-2],以便更好的指导临床的诊断。
作者在此对乙型肝炎HBsAg和抗-HBs定量测定试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法)的分析灵敏度进行了建立与分析。
1材料与方法
材料与仪器高浓度HBsAg和抗-HBs血清各,乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(国药准字S)和表面抗体定量测定试剂盒(国药准字S)(时间分辨荧光免疫分析法),以及DEM-III自动酶标洗板机和FWZ-I振荡仪均由广州市丰华生物工程有限公司提供。
“检测HBsAg血清Panel国家参考品”(批准文号:
[91]卫生参字0003)和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”(批准文号:
[91]卫生参字0004)购于中国药品生物制品检定所。
VICTOR2TMD1420MULTILABELCOUNTER(时间分辨荧光免疫检测仪)为Wallac产品。
方法采用试剂盒0标准品为空白液(BLANK),将高浓度HBsAg和抗-HBs血清加入空白液做系列稀释,组成mL、ng/mL、ng/mL、mL、mL和ng/mL的HBsAg系列检测限品,以及mL、mL、mL、mL、mIU/mL和mIU/mL的抗-HBs系列检测限品。
并将高浓度HBsAg和抗-HBs血清分别用空白液按一定比例稀释,各配得线性检测品。
各用三批试剂测定“检测HBsAg血清Panel国家参考品”和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”,同时做标准曲线。
HBsAg采用双抗体夹心法,抗-HBs采用双抗原夹心法,均按试剂盒说明书严格操作。
空白样品做20次批内重复测定;对其它系列检测限品做天间重复测定,共连续做20天。
实验均在VICTOR2TMD1420MULTILABELCOUNTER上测定荧光值(RF值)。
收集数据,按文献[3]的方法分析TRFIA法HBsAg和抗-HBs定量检测试剂盒的检测低限(LLD)、生物检测限(BLD)、及功能灵敏度(FS),参考文献[4]及血清Panel国家参考品说明书对试剂盒进行检定。
2结果
分析灵敏度空白样品做20次批内重复测定,其它系列检测限品做天间重复测定,共连续做20天。
其系列检测限品的RF值检测结果详见表1。
表1乙型肝炎表面抗原和表面抗体系列检测限品的荧光值检测结果
HBsAg(ng/mL)抗-HBs(mIU/mL)
荧光值163333485631100121729141064168055568431156872114830837
153334135513104671758139757143245737575148972147534700
15313528612296761703338015151355249817199042804840068
14913564568298631734338165154869518710193522884237691
134132445593100891787243463138766808976197652994239438
132333425366120111900042757150763649398211003017337480
13683390521697881565034988149148288203148842132730372
142933445650100311365832543143848397078213272151131768
15683269529492291710637854145359829473218183021138842
16943217571994951587335898153763979096207552940035215
148637426111128821802341683156546917946206403040640363
136037397493104421882640926165453367919207933044740290
146439236356122421887843489174448777255153152506135287
137945076574105611864041151127143487296138742654830282
128134626732109511904548530127551386980170952466734689
176836506244121221933648206122755226501175202437734756
1423338455481151421054493621254580110753209273288238814
137746545157122102080847127133958949022201923247440697
149935815115133292201046388129152459003177752658938917
141836736133125872314940269143352119622190762922740990
2.1.1检测低限HBsAg空白平均值BLANK均值)为,标准偏差(SD)为,抗-HBs空白平均值为,标准偏差(SD)为。
这里采用%的可能性来计算检测低限。
按文献[1]的方法分析:
LLDHBsAg=BLANK均值+3S0=+3×=;LLD抗-HBs=。
HBsAg若以空白RF值均值为检测的起点0,那么有%的可能性,每次只做一个空白时,出现最高的空白RF值较该空白RF值均值高的3倍,即,这些RF值相当于样品具有的HBsAg,即为本方法HBsAg的检测低限。
同理得,较该空白RF值均值高这些RF值即为本方法抗-HBs的检测低限。
将上面所有的RF值减去空白RF值均值,然后求每组的均值和标准差。
见表2。
表2乙型肝炎表面抗原和表面抗体检测系统分析灵敏度的计算
HBsAg(ng/mL)抗-HBs(mIU/mL)
X
SD
CV(%)
X-3×SD
>>>>>>>>>>
现在ng/mLHBsAg组减去空白后的RF值均值为,假定这段范围内HBsAg量和RF值间呈线性.因此相当于:
×()=(ng/mL)。
所以本法HBsAg的检测低限为mL。
同理可得:
本法抗-HBs的检测低限为mIU/mL。
2.1.2生物检测限由表2得,ng/mLHBsAg组%的最低RF值为(-3×),即,已大于空白RF值均值可能有的最高值,说明ng/mL的样品RF值有%的可能性,一定大于空白的RF值,能定量地报告结果。
ng/mL为本方法HBsAg的生物检测限。
同理可得,本方法抗-HBs的生物检测限为mIU/mL。
2.1.3功能灵敏度从表2中可知,ng/mLHBsAg组和mIU/mL抗-HBs组的重复检测变异系数CV%分别为%和%,重复检测变异系数接近并小于20%[5]。
所以,本方法HBsAg和抗-HBs的功能灵敏度为ng/mL和mIU/mL。
线性范围HBsAg和抗-HBs的血清线性检测品,经三批试剂检测,HBsAg线性范围为ng/mL-300ng/mL,抗-HBs线性范围为mIU/mL-1200mIU/mL。
血清Panel国家参考品检定三批HBsAg和抗-HBs定量检测试剂盒分别测定“检测HBsAg血清Panel国家参考品”和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”:
线性参考品测定值均与标定值相关系数r>%,测定值与其真实值的相对误差不大于%;精密性参考品CV%≤%;HBsAgadr亚型及抗-HBs灵敏度参考品的测定值与其真实值的相对误差不大于%,HBsAgadr、adw和ay亚型参考品最低检出量不高于mL;抗-HBs灵敏度参考品最低检出量不高于mIU/mL。
3讨论
分析灵敏度(检测限)是检测系统能检出的最低分析物浓度,包括具有定性意义的检测低限(LLD)和具有定量意义的生物检测限(BLD)及功能灵敏度(FS),特别是定量检测报告能为临床对患者的治疗监测和随访的正确判断提供更多的信息。
因此,在检测系统正式用于实际检测病人标本之前,实验室必须对检测系统的分析灵敏度进行建立或确认。
确定检测系统的可报告低限是最重要的分析性能。
通过本次实验研究,乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒和表面抗体定量检测试剂盒(时间分辨免疫荧光分析法)的LLD分别为mL和mIU/mL,BLD分别为ng/mL和mIU/mL,FS分别为ng/mL和mIU/mL,线性范围分别为ng/mL-300ng/mL和mIU/mL-1200mIU/mL,并均达到中国药品生物制品检定所检定要求。
HBV标志物的检测常用于病人的筛选和乙型肝炎的预防,对低浓度的血清HBsAg及其亚型的有效检测,具有重要的临床和流行病学意义;并且临床实验室一般认为抗-HBs含量mIU/mL为保护临界值,但是抗-HBs含量在mIU/mL-100mIU/mL时认为没有对HBV中和作用,只有定量在100mIU/mL以上时才具有抵抗HBV入侵的作用[6],抗-HBs定量检测对乙肝免疫力的评价具有重要意义。
本实验也表明,TRFIA法乙型肝炎病毒定量检测试剂盒具有灵敏度高,线性范围宽,特异性强的特点,已能有效应用于临床体外诊断和流行病学研究。
参考文献:
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