南京大学仪器分析色谱分析类总结.docx
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南京大学仪器分析色谱分析类总结
I
一、色诰法概论
1.分类
以流动相分:
气相色谱(气液、气固)、液相色谱(液液、液固)
以固定ffl分:
柱色谱(ColumnChromatography)
薄S色谱(ThinLayerChromatography在铺成溥层固体上进行色谱的方法)
纸色谱(利用混合物在纤维素的水分中分配系数不同而使混合物分离)
以分离原理分:
吸附色谱(利用混合物各组分对吸附剂的吸附能力不同,而将各组分分离)
分配色谱(利用混合物的各组分在相间的分配系数不同,而进行各组分的分离)离子交换色谱(基于溶液中离子与离子交换剂的吸附剂表而的离子间的交换作用)凝胶色i普(根据分子最大小不同来实现分离的冃的)
以应用领域分:
分析色谱、制备色谱
2.基本术语
3.
比移值:
把溶质与溶剂移动之速度比称比移值(Rf)。
A.
比.
0.容S因了*(也称为分配容量或分配比人在平衡状态下组分在固定相打流动相中
质量之比。
P.定最校正因子:
要进行组分定量,就要测定组分峰面积,其次要知道比例因数fi,以便把峰面积换算成物质的量,比例因素百即定最校正W子。
(色诰定量中,一般都是釆用相对于某一标准物(S)的相对巫量校正因子或相対摩尔校正因子J
3.基本理论与计算
A.分配系数与分配比
分配系数即组分达到分配平衡后在固定相与流动相间的浓度Z比。
决定于组分与两相热力学性质。
依据热力学函数右:
ApGm
lnK=--^
RTc
故令柱温越低,分配系数K越大,柱内存在量越大,越难留出;反之易流出(影响GC)。
分配比即组分在平衡状态下组分在固定相9流动相中质量之比。
存在式:
C$W$Vm,,Vm
其中,卩为色谱柱相比:
Vm为流动相体积,即死体积:
匕为固定相体积。
B.基本保留方程
用于表示保留时间和柱长、流动速度、分配比、分配系数以及两相体积间的关系(或者也町用保留体枳表示)
LVs
tR=to(l+k')=-(1+K—)
UVm
其中,L为柱长:
u为流动相线速度;k,为分配比:
K为分配系数
由上式可得:
tj)p
C.相对保留值a
相对保留值用來讨论相对组分的分离能力,决定于固定相性质和柱温,值越人,选择性越人,分离越彻底。
值为1,两组分流出峰ft重叠。
相对保留值可以消除由于流动相流速、柱长、填充情况等不能完全觅复而带来的实验误差。
当柱温和固定相物质不变时,W对保留值不变。
_Kz_k?
_%2
D.理论塔板数
塔板理论假定:
塔板间不连续:
塔板间无分子扩散;相间平衡瞬时达到:
塔板分配系数相等:
流动相不连续。
色谱柱的理论塔板数一般为10汽106,n越大分离效果越好。
理论塔板数故有下式:
n十侥;)
冇效塔板数即冇:
H存在H=L/n,H为单位塔板高度。
E.速率理论方程(范式方程)
上述理论塔板对于一些现象无法解释,其忽略传质过理影响因素,故冇下式:
„。
斛昭小」.2冋皿wudiqkPd;
H=一E一+时河;
B
H=A+-+CU
U
其中,6为涡流扩散项,dp为固定相颗粒平均直径,入为不规则填充因子;6为纵向分子扩散项,V为弯曲因子,Dm为组分在流动相中扩散系数:
为流动相传质阻力,3为柱性质W子:
6为固定相传质阻力,q为固定相结构性质因子,df为有效平均液膜厚度;D.组分在固定液中扩散系数。
当U很大时,即U—►8,H=A+Cu曲线呈一直线,即为曲线渐延线,
«截距为A-斜率为G从截距A对U轴作
平行线,则此线与U轴间距离为A项之大小。
由曲线最低点(Hen)向U作垂线,此点与渐近线间距离为B/U对H的作用,渐近线与A线距离为CU对H的作用,为确定最佳操作条件:
H=A+2aZbC.u=/b7Co
故板高与我气线速度冇关系,亦称速率理论方程。
由于许多参数还不能定量求出,因此,还只能定性说明影响板高的因素。
F.分离度
用T定量描述两个色谱峰的分离程度的指标,即相邻两组分色谱峰保留值Z差与峰底宽总和的一半的比值,如下式:
注:
Rs>1.5作为完全分离指标
G.基本分离方程
t
R=^x—'4a1+k;
由上式可得:
R$正比T->/K.flL正比TVH.知增加柱长町提高分离度。
给定分离
度下有:
iR心)1罟j
还可以通过改变a和K來提高分析效果。
二、'〔相色谱分析
1.基本原理与使用条件
'〔相色谱足一种以气体为流动相的柱色谱的分离方法。
凡足在仪器允许条件下能够汽化且热稳定、不真冇腐蚀性的液体或气体均可釆取气相色谱法;对于一些冈沸点过高无法汽化或热不稳定的物质,通过化学衍生化法使其转变后再进行分析。
2.仪器组成与结构
A.
B.
气路系统
气路系统是一个载气连续运行的密闭系统,常见的有单柱单气¥各和双柱双气路两种。
单气路适用于恒温分析,双气路适用于程序升温分析并同时补偿检测器噪声和基线漂移。
其載气多为氮气、氮气、氢气等,进入前需净化剂(分子筛、硅胶、活性炭)处理。
气路压力由稳压阀或稳流阀调节。
其作用包括调节气流鼠和气路气乐两方面。
进样系统
液体样品需汽化后进入。
其进样器液体采取徹量注射器,气体则采取医用注射器或六通阀:
在气化室(金属缠绕加热幺纟,50-500T,要求热容量大,瞬间气化且死体积小)气化,然后进入色谱柱
C.
色谱柱
色谱柱包扌舌填充柱和开tf柱(无细管柱)两类。
填充柱采取不锈钢或玻璃材质,内径3~6mrn,其载体町先以液体形式配比混匀,干燥后填充:
开管柱以石英制成,固定相涂布在毛细管内壁或化学键和在内望上。
D.
温度控制系统
用于设置、控制和测最气化室、柱室、检测室的温度。
气化室温度应使试样瞬间气化但不分解,略髙于沸点;柱室温度引起柱温变化,影响柱效和选择性:
检测室温度影响检测器的灵敏度或稳定性,一般1^于柱温十倍。
楕度tO.rCo
检测系统(检测器)
测最原理:
依据不同物质的导热系数不同,在参比池和测最池分别通入纯载气和组分我气,此时由于气体导热系数不同而带走热量使电阻值不同,从而获得信号:
当参比与测量池均为纯載气时,帯走热量相同使电阻相同,无信号产生。
特点:
一种样品非破坏塑检测器,貝有S高灵敏度和梯定性,可检出1旷级的低含最组分;结构简单、成本低、使用范W广。
它是根据不同气体导热能力不同及
金属热线W有电阻温度系数两个原理设计的检测器。
灵敏度彫响因素:
1)桥电流:
热导池灵敏度与桥电流三次方成正比,较人使池体热丝温差增人,提高灵敏度,过大使热线温度过髙,影响寿命,同时池壁温差较大,増大噪声。
2)载气:
我气与组分的导热系数差越人,其信号越强,一般釆用热导系数较人载壮(H、He),两热丝温差越人,灵敏度越高。
3)检测器温度:
柱室温度波动影响热^^温度稳定性,使灵敏度和稳定性下降,一般要求检测室温度较低,但高于柱温(防止冷凝污染)。
4)池体温度:
池体温度与钩丝温度相基越大,越有利于热传导,检测器的灵敏度也就越髙。
b.FID氢火焰离了化检测器
离子定向
测最原理:
以氢气在空气中燃烧,生成的火焰为能源,使进入火焰的有机物髙温离解,生成止负离子,在火焰外W,设豐一个电场,在电场作用下,运动形成离子流,经放人得到信号。
线性范W操作条件
特点:
一种样品破坏型检测器;灵敏度高,最低检出量达10卫克:
广;死体积小,响应快,可用在快速色谱分析匕:
结构简单,造价低;要求不离,操作条件的变化,对灵敏度影响较小0
灵敏度影响ra素:
一般包《喷嘴内径、电极形状及间距、极化电压高低以及气体流量四个方面。
其中,气体流量需要选择,其他因素则已经由仪器厂家优化。
C,
ECD电子捕获检测器
测量原理:
是一种放射性离子化检测辭。
在放射源(6呐i或駅)作用下,载气通过检测器时被电离(离解为Ni"和b),产生自由离子形成基流,当电负性化合物进入检测器时,捕获电子,使基流下降,产生检测信号的。
特点:
高选择性检测器,对含有电负性原子或基团的化合物具有很高的灵敏度,如厮化物、含氧、含硫、含磷的有机物及紺体化合物、金属有机物、金属螯和物、多坏芳炷等,但对一般非电负性如烷煙等影响应很小。
d.FPD火焰光度检测器
测最原理:
在温度高达2OOO-3OOOK富氢火焰中,硫、磷化合物分别发出350-430nm及526nm的特征波长光,分别用394nm(S)利526nm(P)的滤光片滤光,然后将滤后之光电倍增管转化为电信号测屋。
特点:
线性范M窄,测磷为105,测硫为10^-10^是一种对硫、磷化介物有高选择性的检测器,比对一般有机物敏感度高104倍。
3.固定相
A.载体
能够牢固保留固定液并使它呈均匀薄膜状的无活性物质。
要求:
貝有化学惰性,无表面吸附作用,空穴均匀,比表面大,耐热性强,无催化活性有一定机械强度和浸润性。
多采用硅漩土載体,分红色(适宜非极性固定液)和白色(适宜极性固定液)两种。
由于硅渕土表面存在Si-OH.易形成氢键,故需釆取酸洗、碱洗、烷基化等方法处理,消除緘性中心、酸性中心以及硅醇基活性氢与组分的作用,提高分离效果.
B.固定液
a.
要求:
化学惰性:
热稳定:
操作温度下蒸汽压低,不易流失:
选择性好:
黏度
小:
凝固点低;良好浸润性
b.特征常数(保留扌旨数):
Kovats指数:
将两相邻正构烷炷保留值的对数Z间差值分为100份,保留值位于两
>n
相邻正构烷炷之间组分i的保留指数^S^R-X—Ifito
】x=100n+100二二
其中,t可为调整保留时间(或体积)
Rohrschneider常数:
即用保留指数差ZU表示固定液相对极性,值越大,固定液与
组分作用力越大,选择性越高。
McReynolds常数:
即采取特殊五种物质的120戈条件下的AI之和表示固定液极性。
注:
此处的ZU均采取周定液对角鲨烷的差
肪酸、睛、胺或非极性的^^、瞇、酮等,尤其是对有机物中微最水(先出管)分离。
4.流动相
流动相为气体,常用为氮气、氢气、氮气等且依据检测器选择,通入前须经过净化装置并调节介适的我气流速利流量。
5.分析方法
A.定性
a.
保留值定性:
采用多柱比较,将Kovats保留值对比文献或标准物来定性物质。
也可采取比保®值定性分析,其值仅受温度影响。
-P由—P*T冲
V调整保冊=tdE:
=tdjF•———•—_V调273_K273龙保"m固定液T杠PT柱
其中,j为压力校正因子,K为分配系数,P为固定液密度。
b・色•质联用定性B・定量
mj=fjAj
峰面枳A=1.065hWi/2
校正因子:
绝对校正因子f,受仪器及操作条件限制很人,故多用相对校正W了frf;_fi_"/A_".A
<"mJ人叫A
其中,S为标准物,1为组分
a.
归一化法
条件:
仅适用于试样中所冇组分全出邮的情况;必须已知所冇组分的校正因子fl不适合微鼠组分的测定。
与被测组分性质比较接近(挥发度、极性、溶
出峰位置应位于被测组分附近,且无组分峰影
b・内标法
条件:
试样中不含有该物质;解度等):
不与试样发生化学反应:
响:
内标物为高纯度标准物质,或含最己知物质:
内标物的加入最应接近于己知物质。
通过加入性®相近的己知标准物,进行色谱分离,获得被测组分和内标物峰面积•计算相对量再换算为绝对量。
mjmiIBsAjfjmsAjfj
q%=—=——X—=—X——=—X—
mm-mA-Lm…m
ssSAsfs
C-
校准曲线法
条件:
操作条件稳定,进样体枳一致,适合无内标物的物质测定。
通过已知样品标准成线性关系的前提下,配制近似样品浓度的标准物,测定浓度•则町以下式计算:
Ci%=£c%
6.优缺点
优点:
高效能、灵敏度高、速度快、应用范M、仪器造价低
缺点:
从色i普峰不能直接给出定性结果。
对高沸点(沸点在50(rc以上)物质,目前气柑色i普分析还有闲难。
7.应用
'(周色谱常用于永久性气体及的低碳数化合物的分离。
气液色谱则应用更广,凡是在气相色i普仪允许的条件下可以气化而不分解的物质均可以采取气相色谱法。
除此之外,气相色谱还可用于物理化学研究中的多种参数测量。
8.附加知识点
A.开管柱色谱
特点:
总柱效高:
内径小使得传质阻力极小,涡流扩散不存在,谱带展宽变小。
C.
类型:
涂壁开管柱(固定液涂布玻璃柱内壁)、多孔层开管柱(管壁涂多孔材料,在涂布固定液)、键合型(固定液化学键合于玻璃表面)、交联型(自由基原位分子共价交联使固定液固化).
B.手性分离
色谱法可用于手性化合物的分离,可以分为直接法和间接法两种。
直接法即采取手性选择剂(手性固定相和手性流动和添加剂,后者只用于液相色谱和毛细管电泳法)进行分离。
间接法即让手性衍生化试剂和被分析组分反应,使对映体转变为非对映体,后利用物理性质和化学性质的不同,使其在非手性固定相上分离,最后通过化学转化,使其还原。
三点作用模式:
即在手性分离过程中,要实现有效识别对映体,需要手性固定相与其中一种对映体的至少三个作用中心发生相互作用,其中一个必定市立体化学结构决定。
顼0
归-化法
内榇廉
外标法
计》公式
工“;
1
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C.
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三、高效液相色谱分析
1.基本原理与使用条件
离效液相色谱是一种以液体为流动W的现代柱色谱分离技术,其主要通过与气相色谱仪及经典液相色谱不同的实验条件,提供高压加速分离,对于高沸点、热不稳定的冇机及生化试样的高效分离分析方法。
2.
仪器组成与结构
色谱柱
以不锈钢制成,要求内ffi平滑光洁,接头死体积小,柱长为10-25cm内径柱前加短柱即卫柱,防止污染固定相。
G・
检测系统(检测器)
a.UVD紫外吸收检测器
选择性浓度型检测器,仅对紫外波长竹吸收的物质有响应。
以爪灯为光源,通过参比池和测量池两者之M的透対光的强度差來输出信号。
b.FD荧光检测器
选择性浓度型检测器,先以光源通过分光器分离特定波长的紫外光激发被测物,再以光电倍增管测定产生的荧光强度,适宜痕屋分析。
C.RID示差折光率检测器
通用性检测器,包扌舌偏转式、反射式和干涉型三种,依据参比池与测最池的折光率差不同而产生光电信号。
d.ECD电化学检测器
一般依据电化学原理,分为电导、库仑、伏安和安培四种,常用安培检测器。
性線
黛外检葛《
检测《
逖0检测S
折光检测省
黄尢检测S
毁光度
折光IB数
荧光冬度
电导*
类帝
诜择性
诵用性
诜掙性
诃
10"
10*
10*
最小检出浓度
10«
10"
10«
10'
G小检出S
Ing
lug
lp«
lrn<
悌度洗脱
可以
不可以
可以
不可牧
对流%«另性
不敏感
9感
対沮度敏爆性
低
109
低
2x/r
3.固定相
按照承受压力大小分为刚性固体(多为二氧化硅)和硬胶(多为聚苯乙烯和二乙烯基苯交联物)两类。
按照孔隙深度分为表面参孔型(实心玻璃外覆盖多孔活性物质)和全多孔微粒型(直径10-^pm的硅胶微粒)两类。
表面多孔型孔浅、相对死体积小、出峰快、柱效高但故大进样量受限;全多孔型孔也浅、传质速率快、柱效高、但需较高压力,般人进样比表面多孔人五倍。
4.流动相
要求:
纯度高、黏度低、化学稳定性好、溶剂沸点高于55弋、溶剂町完全浸润固定相并与流动相匹配、与检测器匹配。
5.优缺点
A.高效液相色谱的特点:
分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快
B.高效液相色谱法局限性:
a.
在髙效液相色谱法中,使用多种溶剂作为流动相,当进行分析时所需成本髙于气相色谱法,且易引起环境污染。
当进行梯度洗脱操作时,它比气相色谱法的程序升温操作a杂.
b.
高效液相色谱法中缺少通用型检测器(如气相色谱法中使用热导检测器和氢火焰离子化检测器)。
c.
d.
高效液相色谱法不能替代气相色谱法,去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以H.必需用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。
高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法,在200kPa至IMPa柱压下去分析受压易分解、变性的具右生物活性的生化样品。
6.附加知识点
A.液周吸附色谱
a.原理:
组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。
b.
c.
d.
e.
固定相:
为固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等,校常使用的是5-lOum的硅胶吸附剂。
流动相:
各种不同极性的一元或多元溶剂。
应用:
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对貝有官能团的化介物和异构体有较高选择性。
缺点:
非线形等温吸附常引起峰的拖尾。
B.
C.
化学键介相色i普
原理:
通过化学反应将有机分子键合在載体表面形成柱填允剂,然后混合物和其形成化学键强弱不同,借此分离物质。
分类:
正相(流动相极性小丁•固定相)和反相(流动相极性人丁•固定相)反相影响因素:
碳链长度、碳负载量和衷面覆盖率、载体孔径和纯度、残余硅醇基团数冃。
反柑键合色谱以水(紫外截止波长低,有利于痕量检测)为底溶剂,其中加入A种添加剂(提高选择性),报据分离需要再加入不同比例的打水可混溶的有机溶剂,还可利用二次化学平衡,使不易分析的也可用此法分析。
一般适用于极性较小的样品分离。
离子交换色诰
原理:
采取离子交换剂为固定相,分为阳离子型和阴离子型。
固定相:
合成树脂(强酸SOjH和弱酸COOH,强碱季胺和弱碱NH2)、硅胶.流动相:
含有缓冲体系的金属盐溶液
应用:
离子、离子型化合物或一定条件卜可解离的物质。
a.
b.
c.
d.
a.
b・
D.
C.
d.
离子色谱原理:
在离子交换色谱的基础上,熠加抑制柱(即a换流动相中离子,使其全部转变为水,降低背景影响,但抑制柱需定期再生)或膜离子交换管,再采取电导法测最。
尺寸排阻色谱(凝胶色谱)
原理:
按分子人小分离。
小分子可以扩散到凝胶空隙,由其中通过,出峰最慢:
中等分子只能通过部分凝胶空隙,中速通过;而大分子被排斥在外,出峰最快:
溶剂分子小,故在最后出峰。
固定相:
无机类(凝胶)和有机类(有机物共聚物)
应用:
可对相对分子质量在100-105范国内的化合物按质量分离。
a.
b.
c.
E.
SFC超临界流体色谱法
原理:
采取超临界流体作为流动相,结合GC和HPLC的各自优点。
仪器:
精密控压设备、精密控温设备、柱后有毛细管限流器,其他同HPLC。
流动相:
常用为C02,其中可加入改性剂。
固定相:
采用填充柱或开管柱。
检测器:
为氢火焰离子化检测器或紫外吸收检测器(均对C02无响应)。
应用:
町用于天然产物、农药、高聚物、原油分析,特别适用于一些GC和HPLC不适介的物质分析,但其仪器复杂,可选择流动相冇限。
HLPC的综合分析
a.
b.
c.
d.
e.
人Mb人權合相色《
人小Z钏人a亠W”*
尺寸排谱
<2000
>2000
——离子对或阴离子交換色常
离子对或阳a子交快色《
鯉色一《合柑色a
破固色谱尺'JJtWfeiS
竺尺寸^0用色借(水体东〉
*J/I.
尺寸川《色«(菲水体
四、E细管电泳分析
1-基本原理与使用条件
毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)是离子或者荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按照其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离分析的一种电泳新技术。
2
分离方式的选择
仪器组成与结构
电源电压:
5~30kV
毛细管:
长lOrOOcm内径25~100pm石英材质
进样方式:
巫力注射:
电动进样
3.
检测器:
紫外吸收检测器、PDAD、荧光检测器、碳纤维安培检测器、电导检测器。
影响因素
A.影响选择性W素
离子迁移率:
电解质浓度越人,离子强度越大,离子电荷越小,半径越大,其迁移率越小。
组分电离度
合适配体
B.影响柱效因素
此法无固定相,消除了涡流扩散项和固定相传质阻力项,而细管径人人降低了流动相传质m力,主要是纵向分子扩散项影响柱效.
高电压可提高柱效,且与柱长无关,但增加柱长有利于施加高电斥,电乐极限受毛细管热效应限制。
4.
优缺点
不能分离中性分子,但柱效很高,分离效果很好.
5.应用
用于分离、检测上壌和水等环境中的多环芳火佥:
分离多种阴阳离子:
获得不同价态的无机离子信息:
还可用于临床复杂药物的成分分析
6.附加知识点
A.电渗流迁移率
由于石英管上硅醇基团电离产生阴离子,吸引阳离子形成双电层,强电场作用下向阴极移动,形成电滓流。
故pH和离子强度对电渗流作用冇影响:
即pH越犬,离了强度越小,电渗流迁移率越人。
B.胶束电动毛细管色谱
原理:
通过在溶液中加入表面活性剂使其形成胶束・同时混合物中性分子在胶束内和溶液中达到分配平衡,通过高压下胶束迁移和溶液电渗流的迁移快慢分离物质。
物质的疏水性越强,迁移时间越长。
五-色谱法对比总结
方法
GC
HPLC
超临界流体色谱法
CE
固定柑
固体吸附剂载体和固定液
刚性固体或®胶表面多孔型或全多孔型
微粒S^lOpm
流动相
'(体(氮气、氢气、氮气)
液体
临界状态CO2
液体
主要仪器
气路系统、进样系统、色谱柱、温度控制系统、检测系统
贮液罐、脱气装置、高压泵、梯度洗脱装置、色谱柱、检测系统
贮液罐、净化系统、高压泵、进样系统、色谱柱、检测器、
高压电源、毛细管、极板、检测器
检测器
TCD热导
FID氢火焰离子化ECD电子捕获
FPD火焰光度
UVD紫外吸收FD荧光
RID示差折光率ECD电化学
FID氢火焰离子化
UVD紫外吸收
UVD紫外吸收FD荧光碳纤维安培电导
优点
髙效能、灵敏度高、速度快、应用范W、仪器造价低
分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快
GC*jHPLC优势互补
峰展宽小、柱效高
缺点
从色谱峰不能直接给出定性结果。
对高沸点(沸点在500T以上〉物质,目前气相色谱分析还冇困难。
成本高易污染、缺少通用检测器、fi杂样晶不适用、高压下不稳定样品不适用
可选择流动相冇限,幣个体系处于密闭高压且温度要求精密控制
普通电泳法对中性分子无选择性,低pH卜•阴离子检测困难
影响因素
固定相种类、柱温
流动相性质
压力、温度
电压、离子电荷pH、纵向分子扩散效应、热效应
条件要求
桁密控温、密闭性好、程序升温
室温操作,高压梯度洗脱
精密控温控压
高电压、合适缓冲体系、介适浓度
适用范W
易挥发、热稳定
可溶解在流动相
成分复杂尺不适合前两种方法的
胶束电动可
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- 南京大学 仪器 分析 色谱 总结