RNA提取注意事项样本.docx
- 文档编号:8313010
- 上传时间:2023-01-30
- 格式:DOCX
- 页数:3
- 大小:18.16KB
RNA提取注意事项样本.docx
《RNA提取注意事项样本.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RNA提取注意事项样本.docx(3页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
RNA提取注意事项样本
RNA提取心得/经验/体会/纪律(RNA提取注意事项)!
纪律一:
杜绝外源酶的污染。
注意一:
操作环境干净无灰尘,严格戴好口罩,手套。
注意二:
实验所涉及的离心管,Tip头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。
注意三:
实验所涉及的试剂/溶液,特别是水,必须确保RNase-Free。
纪律二:
阻止内源酶的活性
注意四:
选择合适的匀浆方法。
注意五:
选择合适的裂解液。
注意六:
控制好样品的起始量。
纪律三:
明确自己的抽提目的
注意七:
任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,抽提成功率急剧下降。
注意八:
RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。
Rnase污染的10大来源
1:
手指头–手指头是外源酶的第一来源,因此必须戴手套而且频繁更换。
另外,口罩也必须戴,因为呼吸也是一个重要的酶来源。
戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2:
枪头,离心管,移液器–单纯的灭菌是不能灭活Rnase的,因此枪头和离心管要用DEPC处理,即使是标明为DEPC处理过的。
移液器最好是专用的,用前用75%的酒精棉球搽拭干净,特别是杆子;另外,一定不要使用褪头器。
3:
水/缓冲液–一定要确保无Rnase污染。
4:
实验台面–最起码要用75%的酒精棉球搽拭干净。
5:
内源Rnase–所有组织均含内源酶,故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。
液氮保存/碾磨方法的确不方便,但对有一些内源酶含量很高的组织,却是唯一的办法。
6:
RNA样品–RNA抽提产物可能都会含痕量的Rnase污染。
7:
质粒抽提–质粒抽提往往用到Rnase降解RNA,残留的Rnase要用ProteinaseK消化,PCI抽提。
8:
RNA保存–即使低温保存,痕量的Rnase亦会导致RNA降解。
长期保存RNA的最好办法是盐/醇悬液,因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9:
阳离子(Ca,Mg)–在含这些离子时,80C加热5分钟会导致RNA被剪切,故如果RNA需要被加热,保存液需要含螯合剂(1mMSodiumCitrate,pH6.4)。
10:
后续实验所用的酶–酶均有可能被Rnase污染。
RNase和DEPC处理
1:
高压灭菌是能够灭活部分RnaseA的。
实验证明:
37C与RNA反应,没有灭菌的PBS,活性点为100pg/ml;灭菌后,活性点为100ng/ml。
当然,灭菌后Rnase依然不能认为没有残留。
2:
DEPC在水中半衰期为30分钟。
0.1%的DEPC灭菌15分钟能够认为彻底破坏了DEPC。
破坏后能够闻到一点气味。
3:
在1MTris,1MHEPES,1MMOPS中分别加入1ug/mlRnaseA和0.1%及1%DEPC实验。
结果提示,0.1%DEPC只对MOPS有效,而1%DEPC对三种试剂都有效。
4:
0.01%DEPC,0.1%DEPC,1%DEPC有效去除RnaseA 的浓度分别为:
100ng/ml,500ng/ml,1ug/ml。
但要注意,DEPC灭活后的副产品,对有些后续实验是有影响的。
我也来谈谈RNA的提取,我觉得14楼说的方法很严格,可是有时候我们其实不必在过多的细节上太紧张。
而在有些步骤一定要小心了。
以下的内容,是讲给那些既想偷懒,有希望实验结果有保证的人听的,如果你是习惯于每一步都很严格的人的话,建议还是按照14楼的方法做,因为那样才是正途啊。
好了,下面是给想偷懒,但又不想搞砸实验的战友看的。
用最少的时间,Money,力气,来做出最好的结果,是我们的终极目标(PS:
我相信一句话,懒人推动科技进步!
个人愚见,大家不要拍我啊)。
我是做植物的,因此以植物RNA提取为例子:
一、关于器皿的处理:
枪头ep管最好是用DEPC处理一下,当然如果老板钱多的话,尽管用进口的RNase-Free的吧。
这里,如果你想要偷点懒,也是有办法的,就是少处理一些ep管,因为后面我们会讲到,不是所有的ep管都一定要处理的。
研钵,这个东西按要求是要高温干燥处理的,可是在实际实验中,如果你不处理的话,也不会有太大的影响。
因为在一般我们要处理的材料上都会带有很多的RNA酶,设想一下,一个研磨碎了的细胞会释放多少RNA酶出来。
因此,在研钵上残留的那些RNase,不是导致你RAN降解的原因。
我的做法是,洗干净的研钵,和枪头等一起湿热灭菌即可。
如果你真的很急的话,连湿热灭菌也免了。
关于手套、口罩和实验台。
手套是一个很重要的东西,这个千万不能省,而且实验过程当中要勤换手套。
因为,一般我们在做实验是时候,还要取用很多其它试剂、仪器。
因此手套往往是最有可能污染你样品的东西。
因此千万记得要换得勤快点。
还有,顺便说一下,最好是戴两层PE手套,因为实验过程中,往往手上会出汗,戴一层手套的话,往往脱下来,就很难戴上去了。
戴上两层,外层的手套能够方便更换,免得戴不上,还把PE手套夹到ep管里面,这样可是很危险的!
至于口罩,我认为,不戴也没关系,但不戴口罩的话,建议你少说些话了,特别是不要对这样品。
讲话是时候,带出去的口水,足够降解你的样品了。
工作台的话,我想,能在一个超净台上是最好,普通的bench也能够,可是要保证周围没人干扰,否则,有人冲你打个招呼,那喷过来的口水就够让你的RNA嗝屁了(像口水兵?
)。
二、关于实验过程和试剂
一般,提取植物RNA的方法如下
试剂:
Trizol,氯仿,75%乙醇,异丙醇,DEPC水;
操作:
1)、每100mg组织加1mlTRIZOL试剂,用液氮匀浆后,室温放置到变成液态;
2)、将液体吸到1.5mlEP管中(能够用没有经DEPC处理的ep管),加新开的氯仿0.2ml,振荡15秒。
3)、室温静置2-3分钟后,1rpm,15min,4℃,离心。
4)、取0.5ml上清到ep管(DEPC处理)加等体积的氯仿重新抽提;4℃,1g,15min;
5)、取上清无色水相(约0.6ml)到EP管(DEPC处理过),加0.5ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟;
6)、1rpm,15分钟,4℃,离心。
观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清(小心别倒了沉淀),75%乙醇1.0ml洗涤(用DEPC水新配制)后,7500rpm,5min,4℃离心。
7)、重复洗涤(可选);
8)、去上清,用10ulTip吸干液体。
气干沉淀5-10分钟;
9)、加DEPC水20-30ul,枪打匀,溶解总RNA,测OD值。
10)、电泳,检测RNA质量。
讲一下注意事项和能够偷懒的地方。
Trizol现在我发现好多实验室都是自己做的,因此也不要吝啬,多加一点吧,这个东西能够有效的抑制RNase的活力,情愿偏多,不要偏少。
第1)步,在磨样的时候,注意,千万要保持低温,特别是开始还没加Trizol的时候,千万不要让样品的温度升高了,否则就能够和你的RNA说拜拜了。
在加了Trizol后,情况会好些,如果研磨充分,那就暂时安全了。
第2)步的时候,这里直接加了氯仿,不少protocol上都还要多一步,先离心去渣,取上清后再加氯仿,这两步完全能够合并,而且感觉合并的话,似乎RNA得率还高些!
而且省下一批ep管,还省下一步的时间。
3)、4)和5)就按照protocol做,能够放松点,注意用处理过的ep管就好了,一般不会有降解的危险。
第6)和7)两步的洗涤会明显的减少RNA的盐含量,对提高RNA质量有很大的帮助,当然也会同时损失掉一部分的RNA,因此洗几次,就看你的要求了。
后面几步,大家就要小心了,现在剩下的可都是精贵的RNA了,做了几个小时,可别前功尽弃啊。
最后一步,推荐使用进口ep管,进口管不容易把液体挂在管壁上,这样,将来取用的时候,损失会小不少。
三、其它
在批量提取的时候,建议用个大点的ep管架子,否则ep管挤在一起,手戴着手套,一不小心,就容易打翻样品(哭吧,如果就一份样)!
枪头的话都是高温成型的,如果你使用是枪头是没开封过的,一般不用DEPC处理也没问题。
主要是怕二次污染,有些工厂是用人工包装了,不是机器打包的,那建议处理一下。
友情提示,DEPC是疑似致癌物质,使用是时候千万小心!
我始终认为,安全是第一位的,如果条件允许的话,尽量使用进口ep管和枪头,这样就不用接触DEPC了。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RNA 提取 注意事项 样本