浅论Twist基因RT.docx
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浅论Twist基因RT
浅论Twist基因RT
【摘要】目的建立Twist基因的逆转录聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)条件,为探讨Twist功能学研究奠定方法学基础。
方法根据Genebank中的Twist(NM_000474)基因序列设计引物,以GAPDH为内参照基因(NM_002046),用RNAsimpleTotalRNAkit提取培养的肾癌细胞总RNA,按照QuantscriptRTkitQuantcDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA,PCR扩增操作按照TAKARA公司的LATaqwithGCBufferPCR试剂盒说明书,设置PCR反应体系并优化扩增反应条件,琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
结果采用TAKARA的LATaqwithGCbufferPCR试剂盒并通过PCR扩增条件的优化,成功建立了Twist基因的RT-PCR方法,在肾癌细胞系786-0中扩增出大小为150bp左右清晰的目的条带。
结论成功摸索出了具有复杂二级结构、富含GC的Twist基因的RT-PCR扩增方法,并证明在肾癌细胞系786-0中存在Twist基因的特异性表达。
【关键词】肿瘤;Twist基因;RT-PCR
TheSetupofRT-PCRforTwistGeneinTumorCells
LiuXiaoyan,WangLi,ZhangZhixia,LiJuan,HeTao,LaboratoryofMolecularBiology,LuzhouMedicalCollege,LuzhouCity,SichuanProvince646000,P.R.China
AbstractObjectiveTosetupthereversetranscriptionpolymerasechain(RT-PCR)methodfordetectingTwistexpressionincasetomakefurtherresearchesonitsstructureand AccordingtothehumanTwistgensequenceavailableinGenbank,apairofprimerswasdesignedandthestandardizationwascalibratedbyGAPDHgeneasaninternalcontrol;totalRNAofrenalcarcinomacellline786-0wasextractedbysimpletotalRNAkitandthefirstchainofcDNAwascomposedinaccordancewiththeinstructionofQuantscriptRTkitQuantcDNA;aftertheoptimizationoftheamplifyingreactionconditions,PCRwasprocessedaccordingtotheillustrationofLATaqwithGCbufferPCRkitandtheamplifyingproductwasidentifiedwithagarosegel Twistgene,consistedof150nucleotides,wasspecificallyamplifiedinrenalcarcinomacell ThemethodfordetectinghumanTwistgenewithRT-PCRwassuccessfullysetupandthetargetgenewasexpressedspecificallyinrenalcarcinomacellline786-0.
KEYWORDStumorTwistgeneRT-PCR
Twist是胚胎发育相关基因,编码一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子,在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用[1]。
新近发现Twist具有癌基因的特征,在人类肿瘤的发生、发展、愈后、复发中具有重要作用,在人类多种恶性肿瘤中高表达,在正常组织和恶性程度低的癌细胞中无或极低表达。
Twist基因GC含量高(75%),局部区域GC含量可高达90%以上,具有复杂的二级结构,故其RT-PCR方法的建立相当困难。
本研究以肾癌细胞系786-0为研究对象,建立Twist基因的RT-PCR方法,为探讨Twist在肿瘤尤其在肾癌中的作用机制奠定方法学基础。
1材料与方法
材料人肾癌细胞株786-0(本实验室保存);RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco公司);小牛血清(Hyclone公司);RNAsimpleTotalRNAkit总RNA提取试剂盒、QuantscriptRTKitcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN公司);LATaqwithGCBufferPCR试剂盒、600bpDNAMarker与2000bpDNAMarker(TAKARA公司);其它所用试剂均为国产或进口分析纯。
方法
细胞培养取人肾癌细胞株786-0,复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养,细胞呈单层贴壁生长后每2d换液1次,生长密度达90%时用%的胰酶消化传代。
RT-PCR法检测Twist基因mRNA的表达
细胞总RNA的提取取生长密度达90%以上的细胞,弃培养液,%灭菌DEPC水冲洗两次后,按1mlRZ/10cm2比例加入裂解液RZ,吹打数次使细胞充分裂解,余下的操作按照RNAsimpleTotalRNAkit总RNA提取试剂盒说明书进行。
cDNA的合成取1μg总RNA做模板,按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。
PCR反应取cDNA产物2(l按照LATaqwithGCBufferPCR试剂盒说明书配制25(l反应体系,设计三种方案进行PCR反应(基因对应的引物序列、产物大小和PCR反应条件优化方案详见表1),扩增产物%琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像分析系统观察和保存图像。
表1PCR反应相关参数
2结果
PCR扩增条件方案①中,PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,内参和目的基因各自对应的泳道均存在严重的弥散现象,其中内参泳道对应于DNAMarker250bp位置上端有一较亮条带,说明GAPDH基因已顺利扩增出,而Twist基因对应的泳道无任何条带。
PCR扩增条件方案②中,产物琼脂糖电泳后,GAPDH基因扩增成功,Twist泳道在100bp与200bpDNAMarker条带间有一模糊带,根据分子量大小判断可能为目的基因,在其下端约100bp处还存在一弱带,考虑可能为引物二聚体或其他原因造成的非特异扩增(见图1A)。
PCR扩增条件方案③中,产物经琼脂糖电泳后,150bp左右的目的条带清晰锋利,无拖尾和非特异性杂带等现象,表明此方案是扩增条件的最佳选择(见图1B)。
图1人肾癌786-0细胞系中Twist基因的RT-PCR扩增结果
3讨论
目前研究表明:
Twist在多种上皮细胞癌中过度表达,包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌等。
Twist已被确认是一种癌蛋白,对肿瘤的转移起促进作用。
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、起病隐匿,易转移、生物学行为多变等特点。
与其它恶性肿瘤相比,国内外对肾癌的研究较少,尤其对于Twist是否在肾癌细胞或组织中表达的相关报道甚少。
因此本研究拟以肾癌细胞株786-0为对象,建立Twist基因的RT-PCR检测技术。
在实验过程中,对包括逆转录酶和耐热TaqDAN聚合酶以及PCR反应条件等方面进行了摸索和优化。
Twist基因富含GC,具有复杂二级结构,常规RT试剂盒很难逆转录出有效的cDNA模板,而QuantReverseTranscriptase逆转录酶具有灵敏度高、较强模版兼容性等特点,可通读GC含量高及二级结构复杂的模版,逆转录出高质量的cDNA。
合适的耐热聚合酶的选择是PCR实验中的关键环节,针对Twist基因的结构特殊性,普通的TaqDNA聚合酶很难扩增出目的产物。
我们选用多种DNA聚合酶经过反复实验对比,最终采用了TAKARA公司的LATaqwithGCbufferPCR试剂盒,该试剂盒的LATaq酶混合液结合了Taq酶的高效性与3‘-5‘外切酶的矫正耐热活性,与优化的反应缓冲液(该缓冲体系可使LATaq酶对Mg2+浓度依赖性降低)一起提供了极高的延伸速率和最大程度的聚合保守性。
更为重要的是,体系中的GCbuffer由于能够破坏模板DNA的二级结构,使得Taq酶能够沿着模板顺利延长,特别适合GC含量高和长片段的扩增。
使用该试剂盒,通过对PCR反应条件的优化,最终扩增出了特异的目的基因。
PCR反应参数的优化主要包括循环次数、退火温度、复性时间等。
针对Twist扩增中常出现的二聚体和非特异性现象,我们采用逐步提高预变性温度和退火温度最终确定了PCR反应条件,其中将预变性温度时间定在99℃预变性10min的目的是使变性充分,因变性不完全时,单链GC富集区易于自身配对,形成发夹、环等稳定的二级结构,且DNA双链也会很快复性,影响PCR反应导致扩增不出产物。
之后在温度降到94℃时再冰上加酶,这样既能使模版和引物双链打开,又使酶保持活性。
一系列优化实验的结果表明,适当提高预变性和退火温度,是除了设计特异性引物、选择适合条件的逆转录和DNA聚合酶之外,扩增GC含量高,具有复杂结构基因的可行有效办法。
通过以上各方面条件的筛选和优化,最后成功摸索出了扩增GC含量高、结构复杂的Twist基因的RT-PCR实验条件,可用于快速、灵敏、可靠地检测肾癌中TwistmRNA表达。
【参考文献】
[1]MassariME,Murre proteins:
regulatorsoftranscriptionineucaryoticorganisms[J].MolCellBiol,2000,20
(2):
429.
CastanonI,Baylies Twistinfate:
evolutionarycomparisonoftwiststructureandfunction[J].Gene,2002,287(1-2):
11.
YangJ,ManiSA,DonaherJI,et,aMasterRegulatorofMorphogenesis,PlaysanEssentialRoleinTumorMetastasis[J].Cell,2004,117(7):
927.
RsivatzE,BeckerI,SpechtK,et expressionoftheepithelial-mesenchymaltransitionregulatorssnail,SIP1,andtwistingastricCancer[J].AmJPathol,2002,161(5):
1881.
WangX,LingMT,GuanXY,et ofanovelfunctionofTWIST,bHLHprotein。
inthedevelopmentofacquiredtaxolresistanceinhumancancercells[J].Oncogene,2004,23
(2):
474.
NiuRF,ZhangL,XiGM,et ofTwistinducesangiogenesisandcorrelateswithmetastasisinhepatocellularcarcinoma[J].JExpClinCancerRes,2007,26(3):
385.
JanzenNK,KimHL,FiglinRA,et afterradicalorpartialnephrectomyforlocializedrenalcellcarcinomaandmanagementofrecurrentdisease[J].UrolclinNorthAm,2003,30(4):
843.
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