耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育.docx
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耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育
耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育
摘要:
通过紫外诱变提高嗜酸乳杆菌的耐酸耐胆盐能力。
通过正交试验确定了诱变参数:
20W紫外灯,菌液稀释至OD6000.65左右,照射60s,照射距离为30.5cm,此条件的致死率为90.5%。
诱变处理后的菌体在模拟人肠道胆汁盐浓度(0.3%)以及pH=2的选择性培养基中处理不同时间后,活菌计数,最终筛选出具有耐胆盐能力显著增强的突变体L.a.abr。
在含0.3%胆盐和pH为2的选择性培养基中培养1.5、2.0、2.5h时的存活率分别为19.57%、10.87%和4.78%,而出发菌株的相应存活率分别为3.68%、1%、0.23%。
关键词:
嗜酸乳杆菌;紫外诱变;耐酸耐胆盐能力
EnhancementoftheAcidandBileSaltTolerantAbilityofLactobacillusacidophilusbyUVMutation
乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过
程中产生大量乳酸的细菌
[1]
具有富集微量元素作用能
将无机态微量元素铬富集转化为细胞内的有机态微
量元素,使有机态微量元素吸收迅速且安全,吸收率
提高
[2]
。
我国学者郭本恒在功能性乳制品中关于乳酸
菌的保健功能指出食用酸奶可以降低人体血清胆固
醇的水平的功能。
癌症发病率的高低和膳食组分密切
相关,而含益生菌的膳食己被证明是具有明显降低癌
症发病率的功效
[3-4]
。
乳酸菌还具有增强机体免疫的功
能,HarsharnjitS.Gill等也通过实验发现了乳酸杆菌能
够增强机体的免疫能力
[5]
、维持肠道微生态平衡和肠
管机能,Anderson(1986),Conway等(1989)发现,从仔
猪消化道分离出的多种乳酸杆菌产生的高分子代谢
产物,可抑制一系列革兰氏阳性和阴性病原体的生
长
[6]
、提高营养利用率、促进营养吸收等功能
[7]
。
然而上
述益生作用的发挥取决于乳酸菌能否抵御体内不良
环境,特别是胃酸和胆盐,安全通过消化道,保持较多
的数量和较高的活性到达大肠。
本试验通过模拟肠道的胆汁盐浓度(0.3%)pH=2
的培养基,对嗜酸乳杆菌进行紫外诱变,从中筛选出
耐胆盐能力较强的突变株。
以便其更好地发挥益生作
用,并可为乳制品发酵生产提供优良发酵菌种,为乳
酸菌微胶囊、乳酸杆菌冻干粉等益生菌制剂的生产或
摄生生物食品提供优质菌种。
1材料与方法
1.1菌株和培养基
嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)购自中国
工业微生物菌种保藏管理中心。
培养于MRS培养基。
筛选使用的选择培养基在MRS液体培养基中添加
0.3%的牛胆盐。
1.2生长曲线的测定
[8]
将活化好的菌种按5%(体积比)接种量接种
MRS液体培养基中,37℃恒温静置培养。
每隔2小时
取样在600nm波长下测定OD值,以时间为横坐标,
OD
600
值为纵坐标,绘制嗜酸乳杆菌的生长曲线。
1.3耐胆盐能力的测定
取活化好的嗜酸乳杆菌(OD
600
0.65左右)培养液
1mL,3000r/min离心收集菌体,并用生理盐水洗涤两
次,漩涡振荡制成1mL菌悬液,分装成2管,离心收集
菌体。
一管加入1mL选择培养基,另一管加入1mL
MRS培养基,振荡均匀后37℃静置培养,分别在培养
1.5、2.0、2.5h时,进行菌落计数,计算存活率。
存活率=
用选择培养基处理后长出的菌落数
未处理的菌落数
×100%
1.4紫外诱变
[9-10]
紫外灯照射前,先开灯预热20min~30min。
吸取
1mL菌悬液到培养皿中,开盖于紫外诱变箱中,20W
紫外灯下,通过改变菌液稀释倍数、照射时间和照射
距离(紫外灯管到培养皿的垂直距离)来控制致死率。
诱变结束后向培养皿中倒入45℃~50℃MRS固体培
养基,摇匀,凝固后用牛皮纸包好,整个操作过程需在
黑暗红灯下操作,37℃避光培养3d,计算致死率。
致死率=
N
0
-N
N
0
式中:
N
0
为照射时间为0s的培养皿上再生的单
个菌落数;N为诱变后培养皿再生出的单个菌落数。
1.5紫外诱变参数的确定
先进行单因素试验,确定紫外照射时间、照射距
离及菌液稀释倍数对致死率的影响,在此基础上进行
三因素三水平正交试验,以致死率(90%左右)为指标
确定其最佳诱变条件。
1.6耐胆盐突变菌株的筛选
诱变结束后向培养皿中倒入45℃~50℃MRS固
体培养基,摇匀,凝固后用牛皮纸包好,37℃避光培养
3d,在培养皿中挑选黄色的生长快的菌落,将其编号
Abstract:
ThestudywasdesignedtoenhancetheacidandbilesalttolerantabilityofLactobacillusacidophilus
byUVmutation.Parameterswithalethalrate90.5%forUVmutationdeterminedbyorthogonaltestwere20W
UV,bacteriawasdilutedtoaroundOD
600
0.65,illuminateatadistanceof30.5cmfor60s.Themutantwas
screenedontheselectivemediumwithasimulatedhumanintestinalbilesaltconcentrationof0.3%andpH=2.
Cellcountingwascarriedoutafterincubationfordifferentperiods.L.a.abrwasscreenedoutthatwithan
enhancedabilitytotoleratehighbilesaltconcentrationwithasurvivalrateof19.57%,10.87%and4.78%
afterincubatedfor1.5h,2.0hand2.5hrespectively,whileunderthesamesituation,thestarterbacteriawas
3.68%,1%and0.23%.
Keywords:
Lactobacillusacidophilus;UVmutation;bilesalttolerantability
帖金鑫,等:
耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育生物工程
112并做菌种保藏。
将各菌株接种于MRS液体培养基中,
取OD
600
为0.65左右的培养液,测定各菌株耐胆盐能
力(方法同1.3),并将其与出发菌株进行比较,从中筛
选出耐胆盐能力较强的菌株,命名并保存。
1.7诱变菌株遗传稳定性检验
将诱变菌株接种于MRS液体培养基中于37℃培
养箱中连续传代发酵5代,每次传代都要进行耐酸、耐
胆盐能力的测定。
2结果与分析
2.1嗜酸乳杆菌的生长曲线
嗜酸乳杆菌的生长曲线见图1。
由图1可以看出,嗜酸乳杆菌在MRS液体培养基
中经过一个较短的延迟期后进入对数生长期。
由于培
养基中营养物质减少,嗜酸乳杆菌在培养16h以后进
入平衡期,菌体浓度基本保持不变,因此宜选用培养
8h~12h时间段的嗜酸乳杆菌菌体制成菌悬液,进行
诱变处理。
2.2照射时间对致死率的影响
照射时间对致死率的影响见图2。
从图2可知,当菌液稀释倍数为10
7
、照射距离为
26.5cm时,随着照射时间的推移,UV对嗜酸乳杆菌的
致死率迅速增加,在照射第30秒时,82%的嗜酸乳杆
菌已经死亡。
60s时菌株的致死率均为90%。
60s后,
菌体急剧死亡,当达到90s时致死率达到最大,已为
99%。
2.3照射距离对致死率的影响
照射距离对致死率的影响如图3所示。
由图3可知,当菌液稀释倍数为10
7
、照射时间为
30s时,随着照射距离的缩短嗜酸乳杆菌和保加利亚
乳杆菌的致死率大大提高,当照射距离为18.5cm时,
菌株的致死率达到了90%以上。
由图3还可知,确定
诱变的最佳照射距离为26.5cm,嗜酸乳杆菌的致死率
为75%。
2.4菌液稀释倍数对致死率的影响
菌液稀释倍数对致死率的影响,见图4。
从图4可知,紫外照射时间为30s、照射距离为
26.5cm时,稀释倍数对嗜酸乳杆菌的致死率影响不
大,考虑到稀释倍数过大或过小对计算致死率所带来
的不便,确定诱变的最佳稀释倍数为10
7
。
此时,嗜酸乳
杆菌的致死率为74.3%。
近年来研究表明,致死率在80%~90%左右时的
突变一般为正向突变。
因此对嗜酸乳杆菌紫外诱变选
择了在20W的紫外灯下,诱变稀释倍数为10
6
,紫外
灯照射时间为60s,照射距离为30.5cm的诱变条件
(此时致死率为92.5%)。
李小平在高降胆固醇嗜酸乳
杆菌的紫外诱变选育一文的研究结果基本相同,其致
死率为90.5%
[11]
。
图1嗜酸乳杆菌的生长曲线
Fig.1ThecurveofLactobacillusacidophilusgrowth
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
O
D
6
0
0
02420
培养时间/h
681012141618
图2紫外诱变致死曲线
Fig.2DeathcurveofUVirradiation
100
98
96
94
92
90
88
86
84
82
80
致
死
率
/
%
30120
照射时间/s
6090
图3照射距离对致死率的影响
Fig.3Effectofirraditondistanceomfatalityrate
95
90
85
80
75
70
65
60
致
死
率
/
%
30.518.5
照射距离/cm
26.522.5
图4菌液稀释倍数对致死率的影响
Fig.4Effectofbacteriumconcentrationonfatalityrate
80
78
76
74
72
70
68
致
死
率
/
%
1100
稀释倍数(/×10
6
)
10
生物工程帖金鑫,等:
耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育
1132.5耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的筛选
2.5.1耐酸嗜酸乳杆菌的筛选
嗜酸乳杆菌出发菌株及各诱变菌株在pH为2的
选择性培养基中培养不同时间后存活菌数结果如表1
所示,各菌株的存活率情况如图5所示。
由表1可知,嗜酸乳杆菌,在处理1.5h后,对于
A0、A1和A3活菌数仅降低了一个指数级,而A4菌
株仍保持在10
8
。
处理2h时,A0A1和A4活菌数比
1.5h时降低了一个指数级,而A2和A3保持不变。
处
理2.5h时,A1和A2与A0保持在同一指数级10
6
,而
A3、A4是10
7
。
可以初步判断,A4的耐酸能力最强。
从图5可知A2菌株发生了负突变;A1、A3、A4的
耐酸性均强于出发菌株A0,耐酸能力A4>A3>A1,A4
处理1.5h时其存活率为52.17%,而出发菌株A0仅
为4.78%,处理2.0h时A4菌株存活率为26.52%是
出发菌株(2.17%)的12.22倍,处理2.5h时的存活率
为16.09%是出发菌株(1.30%)的12.38倍。
经SAS软
件统计分析,与出发菌株相比,A2发生了显著的负
突变;A1菌株与A0菌株差异不显著;A3、A4菌株
的耐酸性极显著地高于出发菌株,并且A4极显著地
高于A3菌株。
取A3、A4做菌种保藏,并将A4用于后
续研究。
2.5.2耐胆盐嗜酸乳杆菌的筛选
L.acidophilus在模拟人肠道胆汁盐浓度(0.3%)的
选择性培养基中处理不同时间后的活菌计数结果(表
2)可以初步判断:
诱变得到的嗜酸乳杆菌A2、A3、A4
菌株较出发菌株A0的耐胆盐能力都有所增强,其中
A4耐胆盐能力增加幅度最大,其在不同处理时间后的
活菌数都比其它菌株多。
综合分析可知L.acidophilus在模拟人肠道胆汁盐
浓度(0.3%)pH为2的选择性培养基中处理不同时间
后的活菌计数,诱变得到的嗜酸乳杆菌菌株较出发菌
株A0的耐胆盐能力都有所增强,其中A4耐胆盐能力
增加幅度最大,其在不同处理时间后的活菌数都比其
它菌株多,由图5可以看出,A4菌株的耐胆盐能力最
强,在胆盐浓度0.3%的选择培养基上处理1.5h时,
它的存活率(19.57%)是出发菌株A0(3.68%)的5.32
倍;处理2.0h时,它的存活率(10.87%)是出发菌株
A0(1%)的10.87倍;处理2.5h时,它的存活率(4.78%)
是出发菌株A0(0.23%)的20.78倍。
A4菌株在处理
2.5h后的存活率甚至比出发菌株处理1.5h的存活率
还要高。
经SAS软件统计分析,嗜酸乳杆菌A4在胆盐
浓度0.3%的选择培养基中处理2.5h时其耐胆盐能力
处理时间/h
嗜酸乳杆菌菌落数(平均值±标准误)(/CFU/mL)
A0A1A2A3A4
0(2.20±0.12)×10
8
(2.30±0.08)×10
8
(2.30±0.15)×10
8
(2.20±0.21)×10
8
(2.30±0.14)×10
8
1.5(8.10±0.10)×10
6
(8.50±0.20)×10
6
(1.50±0.12)×10
5
(2.50±0.10)×10
7
(4.50±0.20)×10
7
2.0(2.20±0.09)×10
6
(3.10±0.10)×10
6
(7.60±0.20)×10
4
(1.10±0.21)×10
7
(2.50±0.11)×10
7
2.5(5.00±0.30)×10
5
(2.50±0.12)×10
6
(1.00±0.09)×10
4
(7.50±0.10)×10
6
(1.10±0.12)×10
7
表2嗜酸乳杆菌在胆盐浓度0.3%的选择培养基上不同处理时间后的活菌数
Table2ThenumberofsurvivedL.acidophilusinselectivemediumcontaining0.3%bilesaltatdifferentintervals
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
存
活
率
/
%
A0A4
菌株编号
A1A2A3
2.5h
2.0h
1.5h
图5嗜酸乳杆菌在pH=2的选择培养基中不同处理时间后的存活率
Fig.5SurvivalratesofLactobacillusacidophilusculturedin
selectivemedium(pH2)atdifferentintervals
处理时间/h
嗜酸乳杆菌菌落数(平均值±标准误)(/CFU/mL)
A0A1A2A3A4
0(2.31±0.12)×10
8
(2.10±0.23)×10
8
(2.10±0.45)×10
8
(2.40±0.47)×10
8
(2.30±0.05)×10
8
1.5(1.12±0.08)×10
7
(1.10±0.12)×10
7
(2.50±0.03)×10
6
(6.50±0.41)×10
7
(1.20±0.06)×10
8
2.0(5.01±0.14)×10
6
(7.10±0.21)×10
6
(1.60±0.31)×10
6
(4.60±0.27)×10
7
(6.10±0.19)×10
7
2.5(3.02±0.31)×10
6
(3.50±0.15)×10
6
(1.00±0.11)×10
6
(1.10±0.10)×10
7
(3.70±0.05)×10
7
表1嗜酸乳杆菌在pH2的选择培养基中不同处理时间后的活菌数
Table1ThenumberofsurvivedLactobacillusacidophilusculturedinselectivemedium(pH=2)atdifferentintervals
注:
A0为出发菌株,A1、A2、A3、A4为诱变后存活下来的菌株。
帖金鑫,等:
耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育生物工程
114图6嗜酸乳杆菌不同处理时间后存活率
Fig.6ThesurvivalrateofL.acidophilusatdifferentintervals
25
20
15
10
5
0
存
活
率
/
%
A0A4
菌株编号
A1A3
2.5h
2.0h
1.5h
与A0、A1、A3相比,差异极显著,将A4命名为L.a.abr。
2.6L.a.abr的遗传稳定性
将诱变筛选所得诱变菌株L.a.abr,连续传代培养
5代,每次传代都要在pH为2以及含0.3%胆盐的选
择性培养基中处理2.5h测定其耐酸及耐胆盐能力,结
果如图7。
由图7可以看出,筛选得到的耐酸耐胆盐突变菌
株遗传稳定性较好,不容易发生退化。
表明L.a.abr耐
胆盐能力基本保持稳定,为后续的研究以及作为新的
出发菌株提供稳定的基础。
3讨论
L.a.abr是一株耐酸耐胆盐的嗜酸乳杆菌。
在含
pH为2以及0.3%胆盐的选择性培养基中培养1.5、
2.0、2.5h时的存活率分别为19.57%、10.87%、4.78%,而
L.a的存活率分别为3.68%、1%、0.23%。
由此可见对
于嗜酸乳杆菌,紫外诱变是一种有效的育种手段,通
过紫外诱变,可使其耐胆盐能力显著提高。
人体消化道正常pH范围为2~8,正常胆汁盐浓
度为0.35%~0.5%。
本实验选择性培养基的胆盐浓度
为0.3%pH为2,在确保通过胃的同时更好地模拟了
人体十二指肠的高胆盐环境。
赵瑞香采用MRS培养
基,模拟人体高胆汁盐环境对嗜酸乳杆菌的抗性进行
了研究。
结果表明,在0.3%胆汁盐条件下培养,活菌
数10
6
CFU/mL以上
[12]
,而L.a.abr在同等条件下的活菌
数可达10
7
以上,说明经过诱变的菌种其耐胆盐能力
明显增强。
一般来讲,胃肠道来源乳杆菌对酸的耐受
能力高于对胆盐的耐受能力,肠道来源的乳杆菌对胆
盐的耐受能力高于胃来源的乳杆菌对胆盐的耐受能
力。
大多数人胃肠道源乳杆菌对酸和胆盐的耐受能力
均不强,对酸的耐受性普遍强于对胆盐的耐受性
[13]
。
实
验证明,而L.a在pH为2的培养基中处理2.5h后的
存活率为1.30%;筛选出的L.a.abr在2.5h时的存活
率为16.09%,是L.a的12.38倍。
由此可见,L.a.abr的
耐酸耐胆盐能力比出发菌株都大幅增强,可更好的发
挥益生作用。
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收稿日期:
2012-11-26
图7嗜酸乳杆菌L.a.abr耐酸耐胆盐能力的遗传稳定性
Fig.7Hereditarystabilityofacidandbilesalttoleranceability
ofLactobacillusacidophilusstrainL.a.abr
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
存
活
率
/
%
F1F5
传代次数
F2F3F4
胆盐耐受性
耐酸性
生物工程帖金鑫,等:
耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育
115标回收率为97.78%~100.29%,RSD
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