培养基母液的制备.docx

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培养基母液的制备

实验一培养基母液的制备…………………………………………………1

实验二培养基的配制与灭菌………………………………………………6

实验三无菌操作及种子无菌播种…………………………………………9

实验四激素对器官分化及愈伤组织诱导的影响…………………………13

实验五茎尖培养与脱毒……………………………………………………16

实验六有丝分裂制片技术和显微观察……………………………………18

实验七植物多倍体细胞的诱发与鉴定……………………………………22

实验八植物组织总DNA的提取与测定……………………………………24

实验九毛状根培养…………………………………………………………27

附录………………………………………………………………………32

精选内容

实验一培养基母液的制备

一、实验目的

学习和掌握培养基母液的配制方法和注意事项。

二、实验原理

培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等，由于每种培养基往往含有一二十种化合物，配制起来不仅繁琐，而且还很难达到准确和精确，尤其是生长调节物质和微量元素用量较少，难于准确称量，稍有偏差，就会影响试验结果及试验的重复性。

为解决这一问题，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。

当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

三、实验药品和试剂

NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、NaH2PO4·H2O、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、Na2-EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇（VB6）、盐酸硫胺素（VB1）、甘氨酸、蔗糖、琼脂

四、实验仪器及用具

电子天平（感量为0.0001g）、扭力天平（感量为0.01g）、烧杯（1000ml、500ml、100ml、50ml）、量筒（500ml、25ml）、容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、试剂瓶（1000ml、500ml、100ml）、药勺、玻棒、电炉、石棉网。

五、实验方法与步骤

按组分别配制MS、B5培养基母液，下面以MS培养基母液配制为例进行介绍。

1、大量元素母液的配制（母液1）

各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。

后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。

倒入试剂瓶，贴好标签，注明每配1L培养基需取此液100ml。

保存于冰箱中。

表1MS培养基大量元素母液制备（母液1）

序号

药品名称

培养基浓度（mg/L）

扩大10倍称量（mg）

1

NH4NO3

1650

16500

蒸馏水定容至1000ml

2

KNO3

1900

19000

3

CaCl2·2H2O

440

4400

4

MgSO4·7H2O

370

3700

5

KH2PO4

170

1700

注意：

配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。

为避免此现象发生，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。

特别应将Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。

2、微量元素母液的配制（母液2、3）

MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除铁）组成。

微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O，因此在配制中分母液2、3配制。

按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的电光分析天平称量，其它同大量元素。

配制培养基时，每配制1L培养基，取母液2为10ml，母液3为5ml。

表2MS培养基微量Ⅰ的配制（母液2）

序号

化合物名称

培养基浓度（mg/L）

扩大50倍称量（mg）

1

MnSO4·4H2O

22.3

1115

蒸馏水定容至500ml

2

ZnSO4·7H2O

8.6

430

3

H3BO3

6.2

310

4

KI

0.83

41.5

5

Na2MoO4·2H2O

0.25

12.5

表3MS培养基微量Ⅱ的配制（母液3）

序号

化合物名称

培养基浓度（mg/L）

扩大100倍称量（mg）

1

CuSO4·5H2O 

0.025

2.5

蒸馏水定容至500ml

2

CoCl2·6H2O  

0.025

2.5

3、铁盐母液的配制（母液4）

目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。

配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。

在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeS04和Na2-EDTA螯合不彻底，此时若将其冷藏，FeS04会结晶析出。

为避免此现象发生，配制铁盐母液时，FeS04和Na2-EDTA应分别加热溶解后混合，并不断搅拌至溶液呈金黄色（约加热10-15min），调pH值至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。

配制培养基时，配制1L取此液10ml。

表4MS铁盐母液的配制（母液4）

序号

化合物名称

培养基浓度（mg/L）

扩大10倍称量（mg）

1

Na2-EDTA

37.3

373

蒸馏水定容至100ml

2

FeSO4·7H2O

27.8

278

4、有机母液的配制（母液5）

MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆醇。

配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。

配制培养基时，配制1L取此液10ml。

由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。

被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。

避免此现象发生的方法是配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。

表5MS培养基有机物质母液的制备（母液5）

序号

化合物名称

培养基浓度（mg/L）

扩大10倍称量（mg）

1

甘氨酸

2.0

20

蒸馏水定容至100ml

2

肌醇

100

1000

3

VB1

0.1

1

4

VB6

0.5

5

5

烟酸

0.5

5

5、激素母液配制

植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。

一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/mL为好，需要注意的是：

（1）生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

（2）细胞分裂素类，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。

注意：

所有的母液都应保存在2~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。

五、思考题：

配制母液时为什么要按顺序加入各药品？

溶解CaCl2·2H2O时，为什么要将蒸馏水加热？

实验二培养基的配制与灭菌

一、实验目的

1、了解并掌握常用培养基的组成成分与特点。

2、学习并掌握培养基配制与灭菌的操作方法。

二、实验原理

培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的组成成分和特点显得尤为重要。

由于植物的多样性和生长环境的复杂性与多变性，不可能有一种万能的培养基。

目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。

培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基，如MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合于许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。

三、实验药品和试剂

蔗糖、琼脂、1mol/LNaOH、HCl、各种培养基母液。

四、实验药品

天平、烧杯（1500ml）、医用瓷缸（1500ml）、量筒（500ml）、三角瓶、移液管、玻棒、剪刀、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。

五、实验步骤

（一）培养基配制（以1LMS培养基为例）

1、先量取500ml的蒸馏水于搪瓷量杯内，放于电炉上加热。

2、称取5～8g左右琼脂条（具体多少要根据质量好坏来决定）和30g蔗糖,将琼脂条剪碎倒入正在加热的搪瓷量杯中，边加热边用玻棒搅拌，直至琼脂熔化。

注意：

在加热琼脂过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。

此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。

但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。

3、同时根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量分别量取MS母液，定容至500ml备用。

4、待琼脂融化后，将量筒中的母液缓慢倒入搪瓷量杯中，充分混匀，用蒸馏水定容到1000ml，并用玻棒不停搅拌,使其充分混匀。

5、将称好的蔗糖缓慢倒入搪瓷量杯的混合液中，搅拌溶解。

6、用1NHCL和1NNaOH逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止（在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右）。

注意：

1NHCL配制：

用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

1NNaOH配制：

称取NaOH4g配成100ml溶液。

7、溶化的培养基应该趁热分装。

其份量以50ml三角瓶盛装15～20ml

培养基为宜，试管以其长度的1/4～1/3较好，倒入时要注意不要将培养

液沾在瓶口，以免让杂菌顺培养液侵入瓶内。

无盖的培养容器要用封口膜

封口，外边加一层牛皮纸，用绳子扎紧。

用铅笔在牛皮纸上写上培养基的

代号。

（二）培养基的灭菌

培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。

而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。

因此，培养基的灭菌，是十分重要的环节，常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。

1、高压蒸汽灭菌法

把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。

盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。

加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。

当指针移至1.1～1.2kg/cm2时，即121℃时，维持一定的时间。

由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。

灭菌后要趁热取出锥形瓶，不可久不放汽，让压力锅自行冷却。

培养基自然冷却凝固。

放置1d后再使用。

注意：

（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。

当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。

对蒸馏水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压力也要提高，一般在126℃维持一个小时。

另外三角瓶中的液体不超过总体积的50%，否则当温度超过100℃时，培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。

（2）消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置24-72h。

放置后如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。

另外做好的培养基一般应在1-2周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4℃条件下。

2、过滤除菌

培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中可能会降解。

这类物质需要进行过滤灭菌。

例如一些生长因子，如赤霉素（GA）、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。

先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40℃,再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。

如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再加入。

六、思考题：

试述常用的几种培养基的特点及其适用范围。

实验四激素对器官分化及愈伤组织诱导的影响

一、实验目的

1、了解器官分化和愈伤组织诱导的激素使用差异，验证Skoog模型。

2、了解器官分化和植株再生的过程。

3、掌握离体培养中的转接技术和具体操作步骤。

二、实验原理

各类激素的生理作用具有相对专一性，如生长素促进细胞体积的增大，细胞分裂素促进细胞分裂，赤霉素促进茎的伸长生长等。

但每一种生理现象的控制因素都是极其复杂的，各类激素专一性作用又是相对的。

植物组织培养中细胞的生长、分化、脱分化和再分化过程的各种生理效应往往是多种内、外源生长物质间综合作用的结果。

总的来说，较高浓度的生长素，有利于根的形成而抑制芽的形成；较高浓度的激动素，有利于芽的形成而抑制根的形成。

通过顺序变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化。

愈伤组织（callus）是由受伤组织形成或外植体诱导而成的一团不断分裂增殖的、无一定方向的，由薄壁细胞组成的细胞块。

根据目前的研究情况，几乎已成功地从各种植物诱导出了愈伤组织，也可以说所有的多细胞植物均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。

理论上讲，诱导愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于诱发愈伤组织的培养条件。

其中，激素的成分和浓度是极为重要的因素，通常情况下，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的高速生长非常必要，特别是当细胞分裂素与生长素联合使用时，能强烈刺激愈伤组织的形成。

三、实验材料

菘蓝无菌苗

四、实验药品和试剂

MS培养基、B5培养基；植物激素：

NAA、6-BA等；75%酒精

五、实验仪器及用具

光照培养箱、超净工作台、酒精灯、三角瓶、培养皿、枪形镊子、剪刀、火柴等

六、实验方法与步骤

1、配制MS或B5培养基，向其中分别添加NAA0、0.1、0.5mg/L与

6-BA0.1、1.0、2.0mg/L，共9种组合，分装入三角瓶中高压灭菌15min，取出后冷却备用。

2、操作之前先将无菌室与超净工作台紫外灭菌20～30min，过15min

后再进行操作。

3、于超净工作台内点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭双手，打开生长有

菘蓝无菌苗的三角瓶，三角瓶的瓶口在酒精灯外焰上烧过灭菌。

5、无菌镊子挟出1株幼苗，用灭菌手术剪将部分无菌苗剪成0.5～1cm

的小段，要求每段至少包含一个生长点，直接转入盛有MS或B5培养基的三角瓶中，每一个切段必须直接接触培养基，三角瓶口在酒精灯火焰上烧过灭菌，重新封口。

6、将部分无菌苗分叶片，叶柄、根，分别剪开，叶片切成1～2mm2

的小块，叶柄切段必须每段含一个生长点，分别接入上述培养基中。

7、在光照培养箱中24℃左右，每天10h光照条件下培养3周，观察

生长情况。

七、注意事项

3周后，观察菘蓝幼苗愈伤组织生成和试管苗扩繁情况。

八、思考题

1、如果你发现你培养的菘蓝中出现了微生物污染，对此你有什么解决的方案？

2、愈伤组织培养有何重要意义？

3、统计你所培养的材料的污染率？

愈伤组织率？

不定芽率？

注：

污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％

愈伤组织率（%）=（愈伤组织数/总接种外植体数）×100％

不定芽率（%）=（不定芽数/总接种外植体数）×100％

实验八植物组织总DNA的提取与测定

一、实验目的

了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提植物总DNA。

了解和掌握植物组织总DNA的提取和测定技术。

DNA分子是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。

二、实验原理

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。

植物总DNA的抽提通常采用两种方法：

（1）SDS法：

离子去污剂，过程长，纯度高；

（2）CTAB法：

该方法简便、快速，总DNA产量高（纯度稍次，适用于一般分子生物学操作）。

CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。

CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1～0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70～75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

再经过氯仿/异戊醇（24:

1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

三、实验材料及试剂

新鲜植物叶片，1.5×CTAB，氯仿/异戊醇（24:

1），95%乙醇或无水乙醇等

四、实验仪器及用具

UV－120分光光度计、磨口三角瓶、具塞刻度试管、研钵、移液枪等器皿。

五、实验步骤：

（一）DNA的提取

1．采集适量幼嫩叶片，用液氮研成粉末，0.4g装入1.5ml离心管中（-20℃预冷）。

2．预热1.5×CTAB到95℃，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。

3．立即置于65℃水浴30min，每5min，上下颠倒1次。

4．12000g离心5min。

5．吸取上清液约600μl，加入等体积（600μl）氯仿/异戊醇（24:

1），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。

6．12000g离心5分钟。

7．取450μl上清于一新1.5ml离心管，加入1ml95%乙醇和45μl10MNH4AC，混匀，室温放置10min。

8．12000g离心10min，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。

9．加入50μl0.1TE或无菌水（含20μg/RNase），置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测总DNA浓度及质量。

（二）DNA的鉴定（紫外吸收法）

核酸类物质含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基中都有共轭双键（＝C－C＝），在紫外区260nm处有最高吸收峰，230nm处有最低吸收峰，纯化的DNA在UV－120紫外分光光度计测得有A260/A280≥2即为DNA的典型吸收峰。

只要将第9步提出的DNA粗制品溶解并定容至5ml，即可上机测定。

六、注意事项：

1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-巯基乙醇处理。

2．研钵预冻，粉末至加CTAB前不要融化

3．24:

1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽。

4．所用试剂必需灭菌。

七、思考题

1、植物总DNA降解的可能原因在哪里？

2、提高总DNA产量的措施有哪些？