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10小论文要点
不同小分子醇对反式丁烯醛的影响
王彦恒苏彦斌*
(化学与制药工程学院,生物制药1101班)
摘要:
目的:
通过研究小分子醇对反式丁烯醛的影响,寻找抗心肌缺血药物的线索。
方法:
紫外-可见吸收光谱法检测不同小分子醇对反式丁烯醛的影响。
结果:
成功建立了H2O2诱导酿酒酵母反式丁烯醛生物实验模型,小分子醇可以同反式丁烯醛相互作用,在实验条件下作用时间和浓度对反式丁烯醛具有明显影响,三种小分子醇均使紫外-可见吸收峰红移,甲醇的影响最大。
结论:
不同小分子醇羟基可能同反式丁烯醛的醛基发生作用,使反式丁烯醛的醛基发生电子离异效应,消除反式丁烯醛影响,产生抗心肌缺血效应,可为寻找抗心肌缺血药物提供了有益的线索。
关键词:
小分子醇:
反式丁烯醛:
酵母;心肌缺血
引言
心肌缺血是指心脏的血液灌注减少,导致心脏的供氧减少,心肌能量代谢不正常,不能支持心脏正常工作的一种病理状态[1]。
冠状动脉粥样硬化导致的冠脉狭窄或闭塞是引起心肌缺血最主要、最常见的病因,进而导致心肌缺血缺氧,由此引起的心脏病即大家常说的冠心病,所以冠心病是心肌缺血的“罪魁祸首”[2]。
心肌缺血严重危害中老年人的健康,近年来随着生活水平的提高,冠状动脉粥样硬化呈现年轻化的趋势。
因此心肌缺血是危害人类的重大疾病。
但是由于治疗心肌缺血的药物稀少,且多产生抗药性,所以寻找新的治疗心肌缺血的药物已迫在眉睫[3-5]。
反式丁烯醛中含有共轭双键和醛基官能团,而小分子醇中含至少一个羟基,所以小分子醇与反式丁烯醛可以发生醛与醇缩合形成缩醛类化合物,从而减少反式丁烯醛的含量从而达到治疗心肌缺血的作用[6-7]。
小分子醇对酿酒酵母诱导的反式丁烯醛的研究过程中,通过改变试验中的温度,pH值,酿酒酵母的浓度,反应时间以及H2O2的浓度变化进行找到最佳的作用条件,从而为寻找新的治疗心肌缺血的药物奠定一定的基础,为其提供一丝线索。
醛与醇缩合形成缩醛类化合物的反应是一类重要的有机反应,在有机合成、制药、香科等工业生产领域有着广泛的应用。
然而在缩醛(酮)合成中,目前常用的有效催化剂是强的质子酸,因副反应多,如磺化、氧化、脱水等、腐蚀性强和易污染环境等缺点,使其受到限制。
为了克服上述缺点,人们开发了许多新的催化剂,如杂多酸[8]、固体超强酸[9]、金属有机化合物[10]、室温离子液体[11],碘单质[12]、可膨胀石墨[、金属无机盐等,并取得了可喜的效果。
然而在缩醛合成中,目前常用的有效催化剂是强的质子酸,因副反应多、腐蚀性强和易污染环境等缺点,使其受到限制。
巴豆酸主要用于与乙酸乙烯酯共聚。
该共聚物在书籍装订中用作热融粘结剂,用于纸张生产和纸张产品的处理,墙纸的涂料,胶卷显影剂和静电复印液组分。
此外,巴豆酸还可用于制备各种丁烯酸衍生物。
在进行实验之前,要先建造心肌缺血的生物模型。
心血管疾病康复机制研究的关键技术之一是复制心肌缺血动物模型。
建立适当的动物模型,不仅为该病的发病机制和病理生理改变提供重要的资料,更重要的是促进新药的开发,推进临床诊断和各种治疗方法的进步。
心肌缺血模型共分为四大类,分别是:
急性心肌缺血模型,慢性心肌缺血模型,可控心肌缺血模型,离体心肌缺血模型。
实验采用H2O2诱导酿酒酵母反式丁烯醛的生物实验模型。
探索反式丁烯醛在不同条件下的变化规律,采用紫外分光光谱仪测量反式丁烯醛的峰值,分析不同温度,反应时间,浓度对反式丁烯醛的影响,探讨小分子醇治疗心肌缺血的可能性[12]。
1仪器与试剂
1.1仪器
FA1104分析天平(上海精天电子仪器有限公司)KQ118超声仪(昆山市超声仪器有限公司)W2-100S恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)BPG-9070A电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)PHS-2C精密酸度计(上海大普仪器有限公司)YZ-54B万用电炉(上海树立仪器仪表有限公司)752N紫外分光光谱仪(上海精密科学仪器有限公司)
1.2试剂
乙醇(陕西三桥精细化工有限公司130608)甲醇(东莞市飞海达化工有限公司120816)丙醇(谦裕弘化工有限公司40709)H2O2(天津君博化工有限公司150826)正丁醇(深圳市华昌化工有限公司081124)NaCl(上海万照精细化工有限公司130804)FeCl2(江阴市宇洁环保科技有限公司140829)三氯乙酸(晶茂贸易有限公司120821)
2药品配制
酿酒酵母配制:
取酿酒酵母5g,加入200ml蒸馏水,等待24h后,5000r/min离心,取上清液。
溶液浓度为25mg/ml。
TBA配制:
46mMTBA,1.8464g溶解在200ml冰醋酸99%中,加入2%butylatedhydroxytoluebe乙醇溶液6ml,避光。
TCA配制:
7.5g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水中。
50mMNacl和0.2mMFecl2溶液:
0.146gNacl和0.002gFecl2溶于250ml蒸馏水中,当天配制,避光保存,4h内使用
醇溶液的配制:
配制10%,30%.50%的甲醇,乙醇,丙醇,丁醇溶液
3实验方法
3.1建立H2O2诱导高效活性酵母产生反式丁烯醛生物实验模型
取高纯度反式丁烯醛,稀释1000倍,直接加入TBA1.5mL,煮沸15min,测量紫外-可见吸收光谱。
3.1.1直接建立
取一支试管加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,一号试管静置15min,静止后,取试管溶液2mL,加入4.3mLTCA,混合离心15min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液3mL,测紫外-可见吸收光谱。
3.1.2间接建立
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,一号试管静置10min,,二号试管静置20min,三号试管静置30min,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,加入TBA0.4mL,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,加入TBA0.4mL,0.5mL,0.6mL,沸水浴15min后冷却,离心10min,测紫外-可见吸收光谱。
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,分别加入250μL酵母上清液,150μL酵母上清液,50μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心10min,测紫外-可见吸收光谱。
取三支试管分别加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,调节pH为6,7,8,分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心10min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2小分子醇对反式丁烯醛生物实验模型的影响
3.2.1不同小分子醇对反式丁烯醛的影响
取四支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述四支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL甲醇,乙醇,丙醇,丁醇溶液,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2.2甲醇对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%甲醇,30%甲醇,50%甲醇,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2.3乙醇对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%乙醇,30%乙醇,50%乙醇,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2.4丙醇对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%丙醇,30%丙醇,50%丙醇溶液,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2.5甲醇作用时间对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%甲醇反应5min,10%甲醇反应10min,10%甲醇反应15min,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2.6乙醇作用时间对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,加入4.3mLTCA,离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%乙醇反应5min,10%乙醇反应10min,10%乙醇反应15min,10%,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
3.2.7丙醇作用时间对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%丙醇反应5min,10%丙醇反应10min,10%丙醇溶液反应15min,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱。
4结果与讨论
4.1建立H2O2诱导高效活性酵母产生反式丁烯醛生物实验模型
495
取高纯度反式丁烯醛,稀释1000倍,直接加入0.4mLTBA,煮沸15min,测量紫外-可见吸收光谱,见图2。
495
图2直接测量反式丁烯醛紫外-吸收光谱
4.1.1直接建立
264
图3直接测量H2O2诱导酵母反式丁烯醛紫外光谱图
取一支试管加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静置15min,静止后,取试管溶液2mL,加入4.3mLTCA,离心15min,36℃水浴10min,离心10min,加入4.3mLTCA。
取溶液3mL,测紫外-可见吸收光谱,见图3。
4.1.2间接建立
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述溶液各2mL,加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,离心10min,加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入TBA0.4mL,0.5mL,0.6mL,沸水浴15min后冷却,离心10min,测紫外-可见吸收光谱,如图4。
495
图4TBA含量对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响(单位:
mL)
495
图5H2O2加入时间对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响(单位:
min)
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,一号试管静置15min,二号试管静置20min,三号试管静置25min,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图5。
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,分别加入250μL酵母上清液,150μL酵母上清液,50μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心10min,测紫外-可见吸收光谱,如图6。
495
图6安琪高活性干酵母上清液量对生物实验模型的影响(单位:
μL)
495
523
图7pH对生物实验模型的影响
取三支试管加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,离心10min,36℃水浴10min,离心10min,加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,调节pH为6,7,8,加入TBA0.4mL,沸水浴15min后冷却,离心10min,测紫外-可见吸收光谱,如图7。
4.2小分子醇对反式丁烯醛模型的影响
4.2.1不同小分子醇对反式丁烯醛的影响
取四支试管加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述溶液2mL,加入4.3mLTCA,离心10min,36℃水浴10min,离心10min,加入4.3mLTCA。
取上诉溶液2mL,加入100μL甲醇、乙醇、丙醇、丁醇溶液,加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图8。
495
506
504
451
图8不同小分子醇对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
4.2.2甲醇对反式丁烯醛的影响
取三支试管加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL。
取上述三支试管溶液各2mL,加入4.3mLTCA,离心10min,36℃水浴10min,离心10min,加入4.3mLTCA。
取上诉溶液2mL,加入100μL10%、30%、50%甲醇,再加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图9。
508
495
图9不同浓度甲醇对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
4.2.3乙醇对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%、30%、50%乙醇,加入TBA0.4mL,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图10。
501
495
507
图10不同浓度乙醇对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
4.2.4丙醇对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入TCA4.3mL,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%、30%、50%丙醇,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图11。
495
508
图11不同浓度丙醇对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
4.2.5甲醇作用时间对反式丁烯醛的影响
506
495
图12甲醇作用时间对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%甲醇,一号试管反应10min,二号试管反应20min,三号试管反应30min,分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图12。
4.2.6乙醇作用时间对反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,再离心10min,再加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%乙醇,一号试管反应10min,二号试管反应20min,三号试管反应30min,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图13。
495
508
图13乙醇作用时间对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
4.2.7丙醇作用时间对反式丁烯醛的影响
495
500
506
图14丙醇作用时间对H2O2诱导酵母反式丁烯醛的影响
取三支试管分别后加入50mM氯化钠和0.2mM二氯化铁溶液2mL,加入250μL酵母上清液,30%过氧化氢10μL,静止后,取上述三支试管溶液各2mL,分别加入4.3mLTCA,混合离心10min,36℃水浴10min,离心10min,加入4.3mLTCA,过滤。
取上诉溶液2mL,分别加入100μL10%丙醇,一号试管反应5min,一号试管反应10min,一号试管反应15min,再分别加入0.4mLTBA,沸水浴15min后冷却,离心15min,测紫外-可见吸收光谱,见图14。
4.3讨论
实验过程中直接测量反式丁烯醛的最大吸收峰为264nm,间接测量反式丁烯醛的最大吸收峰为495nm,实验的目的是改变反式丁烯醛的最大吸收峰,从而为寻找新的治疗袭击缺血药物提供线索。
在建造反式丁烯醛生物模型时,发现加入TBA的体积为0.4ml时最为合理,使用250ul安琪高活性干酵母上清液时峰形最好,直接建造生物模型时经多次实验发现直接测取反式丁烯醛时,峰值不稳定,且经常不出现峰值,间接测量较为稳定,且数值变化不大,所以选择间接建立生物模型。
考察不同小分子醇对反式丁烯醛的影响时,加入甲醇时的最大吸收峰为508nm,峰值位移了13个单位,且多次实验位移变化不大,较为集中,所以甲醇可以使用;加入乙醇时最大吸收峰为506nm,峰值位移11个单位,较为合理,多次实验位移位置较为集中,可以使用;加入丙醇时最大吸收峰为507nm,位移12个单位,较为合理,且多次实验位移变化较为集中,可以使用;加入正丁醇时最大吸收峰为459nm,但多次实验后发现位移变化较为分散,规律性差,做舍弃处理。
探索小分子醇浓度对反式丁烯醛的变化影响时,浓度为50%的小分子醇的峰形最好,且多种小分子醇均如此变化,可能是因为小分子醇与反式丁烯醛发生醛酮缩合反应,小分子醇浓度较高,可以作为带水剂存在,所以在一定浓度的小分子醇越高越好,,但是小分子醇30%与50%浓度时,峰形几乎重合,所以最高浓度应不超过50%的浓度梯度。
且浓度的变化一般情况下不产生位移变化,只产生峰高变化、
探讨小分子醇加入时间对反式丁烯醛的变化影响时,发现,小分子醇加入时间越短,峰值位移越大,时间过长会使最大吸收峰向标准曲线方向位移,造成这种现象的原因可能是小分子醇与反式丁烯醛反应不稳定,时间过长是结合物分解还原成反式丁烯醛。
5结论
心肌缺血可能原因是反式丁烯醛作用于心肌线粒体的DNA。
小分子醇羟基可能与反式丁烯醛的醛基相互作用,产生电子离异效应,可能产生抗心肌缺血的作用。
成功建立H202诱导酿酒酵母反式丁烯醛生物实验模型,紫外可见吸收光谱检测生物实验模型的峰值在495nm处,小分子醇可能具有抗反式丁烯醛作用,影响小分子醇对反式丁烯醛的作用的因素有作用时间和浓度,作用时间越短,峰值越好,作用时间过长会使峰值向蓝方移动,浓度越高,作用效果越好,浓度过低,位移不明显,小分子醇的羟基可能与反式丁烯醛的醛基相互作用,使反式丁烯醛的醛基发生电子离异效应,消除反式丁烯醛影响,产生抗心肌缺血效应,为寻找抗心肌缺血药物提供线索。
参考文献
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