原液稳定性补充概论.docx
- 文档编号:8212971
- 上传时间:2023-01-29
- 格式:DOCX
- 页数:18
- 大小:505.72KB
原液稳定性补充概论.docx
《原液稳定性补充概论.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《原液稳定性补充概论.docx(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
原液稳定性补充概论
重组人白细胞介素-12原液初步稳定性研究
1.试验对象
1.1实验对象
广州市恺泰生物科技有限公司生产的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)原液。
1.2试验试剂及仪器
见附录一。
重组人白细胞介素-12(rhIL-12)原液批号为:
20131120。
2.试验内容
2.1考察在生产贮存过程中对rhIL-12原液稳定性的影响因素
rhIL-12的分离提纯都处于液体状态,这对蛋白分子极不稳定,纯化后需在低温(-80℃)冷冻贮存。
在原液检测及生产成品过程中,需要在室温和2~8℃的条件下操作,并且样品需要自冷冻状态下解冻为溶液,故考察室温、2℃~8℃的条件下原液的稳定性及反复冻融对rhIL-12原液的蛋白含量、生物活性及纯度影响。
试验过程中样品采用15ml无菌离心管包装,批号为20131120。
2.1.1温度对rhIL-12原液稳定性的影响
取样品分别放置于室温(实验室温度控制在21℃~26℃之间)、2℃~8℃(4℃冰箱)。
室温放置的样品在第0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h取样检测,4℃放置的样品在0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d和15d时取样检测。
进行样品的蛋白含量、生物活性、HPLC纯度和电泳纯度测定,并分析这四个指标随时间的变化情况,样品出现明显变化后,停止取样检测。
2.1.2多次冻融对rhIL-12原液稳定性的影响
rhIL-12原液在-80℃、4℃冻融多次,取样进行蛋白含量、生物活性、HPLC纯度和电泳纯度测定,并分析这四个指标随时间的变化情况。
3.考察项目的检测方法
3.1蛋白含量
方法见附录四,参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》,蛋白含量标准应为0时的80%-120%。
3.2生物活性
具体步骤见附录二,参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液生物活性检定标准,以国际参考品作为参考品,计算比活性,检测各取样点比活性不低于0时比活性的80%为合格。
3.3高效液相色谱法(HPLC)纯度检测
HPLC纯度检测方法见附录三
(二)。
参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液纯度检定标准,纯度不低于95%为合格。
3.4电泳法(非还原SDS-PAGE)纯度检测
非还原SDS-PAGE纯度检测方法见附录五。
参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液纯度检定标准,纯度不低于95%为合格。
3.3数据处理
比较每批样品各取样点的蛋白含量、比活性和0时的蛋白含量、比活性,分析样品的蛋白含量和活性变化。
用重复测量的方差分析法,比较样品随时间变化的蛋白含量和生物活性差异,多重比较采用LSD法。
使用SPSS13.0软件进行处理,数据以
表示,显著性为P<0.05。
4.结果
4.1影响因素试验结果
4.1.1温度对rhIL-12原液影响
不同温度条件下,各时间点样品的蛋白含量、生物活性和纯度的检测结果见表1、表2及附图1、图2、图3、图4。
表1.室温放置对rhIL-12原液蛋白含量、比活性及纯度影响结果(
,n=6)
放置时间
比活性(×106IU/mg)
含量(ug/ml)
HPLC纯度(%)
电泳纯度(%)
实测
是否合格
实测
是否合格
实测
是否合格
实测
是否合格
0h
9.57±0.16
合格
198±18
合格
99.90
合格
99.9
合格
1h
9.57±0.68
合格
197±13
合格
98.75
合格
99.9
合格
2h
9.95±0.30
合格
198±20
合格
97.44
合格
99.9
合格
4h
9.74±0.64
合格
190±09
合格
98.86
合格
99.9
合格
8h
7.68±0.75**
合格
191±13
合格
98.56
合格
99.9
合格
24h
6.55±0.23**
不合格
200±17
合格
99.00
合格
99.9
合格
48h
4.35±0.32**
不合格
206±16
合格
98.92
合格
99.9
合格
注:
**:
与0h时比较P<0.01。
由表1可知,室温下放置的样品,与0时样品比活性相比,8h、24h和48h时样品的比活性有显著性差异(P<0.01),而1h、2h和4h时的样品无显著性差异,说明rhIL-12原液室温条件下放置8h后比活性开始下降,但不低于0时比活性的80%,仍合格,至48h时已下降超过50%;样品在各个取样时间点的蛋白含量和纯度均合格。
表2.4℃放置对rhIL-12原液蛋白含量、比活性及纯度影响结果(
,n=6)
放置时间
比活性(×106IU/mg)
含量(ug/ml)
HPLC纯度(%)
电泳纯度(%)
实测
是否合格
实测
是否合格
实测
是否合格
实测
是否合格
0d
9.67±0.19
合格
204±18
合格
98.63
合格
99.9
合格
1d
9.41±0.12
合格
199±13
合格
99.31
合格
99.9
合格
2d
9.53±0.30
合格
199±20
合格
95.10
合格
99.9
合格
3d
9.34±0.26
合格
193±10
合格
96.15
合格
99.9
合格
4d
9.79±0.49
合格
198±07
合格
95.45
合格
99.9
合格
5d
9.79±0.45
合格
199±14
合格
97.01
合格
99.9
合格
10d
9.65±0.24
合格
204±15
合格
97.58
合格
99.9
合格
15d
6.58±0.39**
不合格
190±09
合格
99.22
合格
99.9
合格
注:
**:
与0h时比较P<0.01。
由表2可知,与0时样品比活性相比,4℃放置10天之内的各时间点样品活性未出现显著下降(P>0.05);15d的样品比活性与0时相比有显著性差异(P<0.01),低于0时比活性的30%以上,不合格。
样品在各个取样时间点的蛋白含量和纯度均合格。
4.1.2多次冻融对rhIL-12原液影响
rhIL-12经多次冻融后,其蛋白含量、生物活性和纯度的变化见表3和附图5、图6。
由表3可知,与初始样品的比活性相比,rhIL-12原液在第5次冻融后有显著性差异(P<0.01),说明rhIL-12经5次冻融后生物活性下降,与初始样品相比下降超过20%,6次冻融后比活性与初始样品相比下降30%;样品经6次冻融后蛋白含量及纯度均合格。
表3.多次冻融对rhIL-12原液生物活性及纯度影响结果(
,n=6)
冻融次数
比活性(×106IU/mg)
含量(ug/ml)
HPLC纯度(%)
电泳纯度(%)
实测
是否合格
实测
是否合格
实测
是否合格
实测
是否合格
0
9.67±0.34
合格
197±11
合格
97.04
合格
99.9
合格
1
9.79±0.45
合格
185±11
合格
97.37
合格
99.9
合格
2
9.97±0.65
合格
198±17
合格
97.37
合格
99.9
合格
3
9.65±0.36
合格
190±08
合格
96.90
合格
99.9
合格
4
9.95±0.42
合格
188±17
合格
96.91
合格
99.9
合格
5
7.51±0.62**
不合格
206±15
合格
96.71
合格
99.9
合格
6
6.81±0.32**
不合格
193±10
合格
95.01
合格
99.9
合格
注:
**:
与冻融前比较P<0.01。
5.结论
rhIL-12原液生物活性受温度影响较大,在生产过程中应尽量避免在高温环境下操作;多次冻融对rhIL-12的生物活性亦有较大影响,故其储存应考虑装量,尽量使每个包装的原液冻融后一次性用完,避免再次冻融造成失活和装量不合适造成浪费。
附图1-125℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置前)
附图1-225℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置1h)
附图1-325℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置2h)
附图1-425℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置4h)
附图1-525℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置8h)
附图1-625℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置24h)
附图1-725℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置48h)
附图2-14℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置前)
附图2-24℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置1天)
附图2-34℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置2天)
附图2-44℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置3天)
附图2-54℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置4天)
附图2-64℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置5天)
附图2-74℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置10天)
附图2-84℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响(放置15天)
附图3-1反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融0次)
附图3-2反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融1次)
附图3-3反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融2次)
附图3-4反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融3次)
附图3-5反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融4次)
附图3-6反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融5次)
附图3-7反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响(冻融6次)
附图425℃放置对rhIL-12原液SDS-PAGE纯度影响
备注:
M蛋白标准
1.25℃放置0小时;2.25℃放置1小时;3.25℃放置2小时;
4.25℃放置4小时;5.25℃放置8小时;6.25℃放置24小时;
7.25℃放置48小时
附图54℃放置对rhIL-12原液SDS-PAGE纯度影响
备注:
M蛋白标准
1.4℃放置0天;2.4℃放置1天;3.4℃放置2天;4.4℃放置3天;
5.4℃放置4天;6.4℃放置5天;7.4℃放置10天;8.4℃放置15天
附图6反复冻融对rhIL-12原液SDS-PAGE纯度影响
备注:
M蛋白标准;
1.冻融0次;2.冻融1次;3.冻融2次;4.冻融3次;
5.冻融4次;6.冻融5次;7.冻融6次;
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 原液 稳定性 补充 概论