《乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒1 2型核酸检测试剂盒PCR荧光法操作规程》.docx

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《乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒12型核酸检测试剂盒PCR荧光法操作规程》

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程

1.目的

规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。

2.原理

2.1汇集：

吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。

2.2提取：

病毒核酸提取的方法为磁珠法。

试剂盒提供之内对照（IC）为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。

标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。

加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。

洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。

纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。

2.3扩增：

采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。

在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。

通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。

选择性PCR扩增：

采用UNG-dUTP抗污染系统。

在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。

UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。

2.4质量控制原理

为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。

2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。

2.4.2低浓度阳性质控品监控系统假阴性，如果低浓度阳性质控品检测结果为阴性，说明实验存在假阴性或灵敏度下降的风险，因此实验中的阴性结果均需复测。

2.4.3内对照分为DNA内对照和RNA内对照，是每个反应管中的阳性质控，用于监控单个反应管中DNA与RNA的假阴性风险，如果标本检测结果为阴性，其DNA内对照与RNA内对照结果必须为阳性，否则提示该标本的扩增受到抑制，该阴性检测结果有假阴性风险，需要复测。

3.适用范围

适用于核酸实验室采用核酸技术进行的HBV、HCV、HIV三项单管混样检测。

4.职责

4.1授权的检验人员负责试验操作、结果判读，作好相关记录，对检测结果的真实性和有效性负责。

4.2授权的监督人员负责监督该规程执行。

5.原始样品系统

血浆

6.材料与设备

6.1消耗品

6.1.1乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法），苏州华益美生物科技有限公司；

6.1.296孔深孔板

6.1.31.5ml离心管（手工实验用）和2mlAxgen离心管（用于配置PCR反应液）；

6.1.45ml汇集管；

6.1.596孔扩增板或八连管；

6.1.6带滤芯并经灭菌处理的Tip头；

6.1.7自封袋；

6.1.8磁棒套管；

6.1.9留样板和封膜

6.2设备

6.2.1HAMILTONSTAR全自动样品处理系统；

6.2.2MeDiProSuperPureSystem-32核酸萃取仪；

6.2.3ABI7500荧光定量PCR仪；

7.检测环境

7.1符合二级生物安全实验室条件。

工作环境要求空气流通、照明充足；室内环境整洁、干净并配有消毒设备。

7.2实验室温度：

20-30℃；湿度40-60%。

8.程序步骤

8.1试剂准备区操作

8.1.1消耗品的准备和深孔板反应盘的预分装

8.1.1.1常规实验

清点当日试验所需的消耗品，移送标本制备区，并做好记录。

8.1.1.2手工实验

8.1.1.2.1预分装洗涤液A、洗涤液B、洗脱液，需充分混匀，使用移液器分配至反应盘L-2

8.1.1.2.2可于前一工作日预分装4.2ml核酸萃取液到5ml管；

8.1.2反应液的配制

8.1.2.1常规操作

8.1.2.1.1从-20℃冰箱取出试剂的反应液A、反应液B、反转录酶、RNA保护剂、Taq酶；室温溶解、平衡（反应液的配制时间应控制在15—20分钟，则平衡时间大约10分钟），于震荡器上充分混匀。

组分

用量

反应液A

10μl/T

反应液B

10μl/T

反转录酶

1.5μl/T

RNA保护剂

0.5μl/T

Taq酶

1μl/T

8.1.2.1.25000转/分离心30秒以消除气泡。

8.1.2.1.3更换无粉手套；标记2ml离心管（配制量、使用日期），按照下表配制反应液（反应液量为n（标本数量/8）+4（NC、PC、室内阳性质控品、阴性质控品各一孔）+2人份（富余量）。

8.1.2.1.4于震荡器上充分混匀，手动高速（5000转）离心约20秒以消除气泡。

8.1.2.1.5将配制好的反应液送交标本制备区，也可短时（5min之内）存于4℃冰箱。

8.1.2.2手工操作

8.1.2.2.1同8.1.2.1.1至8.1.2.1.4。

8.1.2.2.2乳胶手套外戴上薄膜手套，取用扩增板或八连管于托盘上。

8.1.2.2.3将配制好的反应液按照H`-A`固定方向依次分配，每孔20μl（吸头垂直加样，避免碰壁），分配数量为n（标本数量）+4（NC、PC、室内阳性质控品、阴性质控品各一孔）。

8.1.2.2.4目测每孔是否足量、超量。

8.1.2.2.5分配好的扩增板或八连管放入自封袋中，于袋上标记，通过传递窗送交标本制备区，也可短时（5min之内）存于4℃冰箱。

8.2标本制备区操作

8.2.1标本准备：

8.2.1.1将标本按顺序转移到32孔样品架,条码面向右侧，使用STAR将标本管献血码扫描入“**/NAT_TEST_RECORD”中；剔除酶免、ALT检测反应性标本。

8.2.1.2在生物安全柜中逐个去除标本管管盖。

8.2.2按照《核酸实验室血液检测标识的管理程序》粘贴汇集管、深孔板、留样板所需条码。

8.2.3常规试验

8.2.3.1【HAMILTON–MSS系统准备流程】

1.保证仪器正常通电，要求使用不间断电源（UPS）

2.检查废弃吸头收集框是否套有一次性垃圾袋（每次实验后立即清理并更换新的垃圾袋）

3.启动HAMILTON工作站模块及对应电脑电源，

注：

应先开电脑，后开机器

4.启动MeDiProSuperPureSystem-32工作站模块电源，开启模块紫外灯自动照射10分钟

8.2.3.2【HAMILTON–MSS系统实验流程】

1.装载加样尖到HAMILTON工作站模块加样尖区域。

2.装载96孔反应盘到HAMILTON工作站模块反应盘区域。

3.装载PCR扩增反应盘到HAMILTON工作站模块反应盘区域。

4.装载试剂槽到HAMILTON工作站模块试剂区域。

5.取出核酸萃取液、载体RNA和内标，平衡至室温，并充分混匀。

按下表所列方案配制混合液。

核酸萃取液

4.2ml/test×n

载体RNA

10μl/test×n

内标

5μl/test×n

注：

n=待测样本数

6.取出核酸萃取液/载体RNA/内标混合液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和磁珠悬液，充分混匀，分别加入对应的试剂槽。

7.运行试剂分装程序，将核酸提取试剂分装入96孔反应盘中。

试剂分布见下表。

反应盘L-2（所列为左半边模式，右半边与左半边相同）

1/7

2/8

3/9

4/10

5/11

6/12

A

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

B

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

C

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

D

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

E

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

F

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

G

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

H

/

洗涤液A1ml

/

洗涤液B1ml

/

洗脱液100μl

8.插入标本载架、汇集管载架到HAMILTON工作站模块对应区域。

9.运行标本汇集程序，完成标本汇集。

10.取掉标本管载架，整理标本并2~8℃暂存。

11.运行核酸提取程序，进行汇集标本的裂解，然后分装入96孔反应盘中，具体分装见下表。

反应盘L-1（所列为左半边模式，右半边与左半边相同）

1/7

2/8

3/9

4/10

5/11

6/12

A

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

B

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

C

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

D

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

E

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

F

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

G

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

H

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

900μlMix

注：

Mix为核酸萃取液/载体RNA/内标混合液加入样本后的萃取混合液。

目测反应盘（深孔板），检查分配的试剂是否达量；硅胶盖（经75%酒精浸洗，紫外线灯照射）封反应盘L-1，封板膜封反应盘L-2，并压实。

12.96孔反应盘移入MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取模块中。

13.执行下表所示的MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取程序，进行核酸提取。

MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取程序

Lysis-4200反应盘L-1

槽位

混合时间m

磁吸时间s

加温时间m

磁棒

混合速度

体积ul

暂停

1

1

50

0

ON

中

900

OFF

2

1

50

0

ON

中

900

OFF

3

1

50

0

ON

中

900

OFF

4

1

50

0

ON

中

900

OFF

5

1

50

0

ON

中

900

OFF

6

1

50

0

ON

中

900

ON

反应盘L-2

槽位

混合时间m

磁吸时间s

加温时间m

磁棒

混合速度

体积ul

暂停

2

2

50

0

ON

中

1000

OFF

4

2

50

0

ON

中

1000

OFF

6

10

60

10

ON

中

100

OFF

4

1

0

0

OFF

中

1000

On

注：

程序第一次暂停时移出反应盘L-1，换上反应盘L-2，按「RUN」继续执行程序，完成核酸提取。

将反应盘L-1底部固定上金属条（固定于反应盘第6和第12列处）后置于MeDiProSuperPureSystem-32机器上（使用前经紫外线灯照射20min），调用并执行程序“Lysis-4200”。

待机器第一次鸣叫时（暂停），取下反应盘L-1；将反应盘L-2固定上金属条后置于机器上，按“自动运行”让程序继续执行。

待机器再次鸣叫，程序结束（使用后紫外线灯照射20min）。

取下反应盘b卸取金属条，反应盘b的第6或第12列孔内的洗脱液即为PCR扩增反应用核酸模板。

将反应盘L-2置于STAR指定位置。

14.完成核酸提取的96孔反应盘回HAMILTON模块中。

15.取出扩增反应液A、扩增反应液B、逆转录酶、RNA保护剂和Taq酶，配制PCR扩增试剂，充分混匀，放置于2ML离心管中，从试剂准备区转移到标准制备区，加入对应试剂槽。

16.运行PCR扩增试剂分装程序，将PCR扩增试剂和提取好的核酸模板分装到PCR反应盘中。

目测扩增板液体分配是否足量，封膜是否与扩增板粘贴紧密，无气泡。

如采用八连管，应保证八连管盖盖紧，并置于载架上传递。

17.PCR反应盘或八连管通过传递窗运转到ABI7500扩增仪，进行核酸扩增荧光检测。

8.2.3.3【HAMILTON–MSS工作站系统关闭流程】

1.实验结束后，关闭HAMILTON–MSS工作站系统运行程序窗口,关闭模块电源，

2.注：

应先关闭机器电源，后关闭电脑

3.取下剩余加样尖盒,留作下次使用。

4.取下废弃吸头收集框的垃圾袋扎好，转移至扩增去医疗垃圾暂存处，需高压灭菌后丢弃。

5.标本架放入75%的乙醇中浸泡30分钟后取出晾干备用。

6.清洁垃圾袋上方的吸头挡板用酒精充分擦拭表面，晾干后备用。

7.先后用微湿清洁布擦拭，再用含75%酒精棉纱擦拭工作台面。

8.打开MeDiProSuperPureSystem-32工作站模块紫外灯自动照射10分钟。

9.打开实验区域固定紫外灯，照射60min。

10.实验区域进行1小时或1小时以上的通风。

8.2.4手工试验

8.2.4.1试剂准备（试剂准备区）

1.预分装洗涤液A、洗涤液B、洗脱液，需充分混匀，使用移液器分配至反应盘L-2（试剂准备区）

2将lysis置于室温平衡30min。

（样本制备区）

3确保室内温度在25℃左右。

4将样本、IC、Ploy（A）RNA于室温溶解。

（样本制备区）

8.2.4.2样本处理（标本制备区）

1.汇集操作：

准备汇集所需要的适当数量的1.5ml管依次粘贴汇集条码或标记POOL编号，并置于试管架上。

用移液器（20-200μl）依次吸取标本血浆150μl加入到对应的汇集管中，8份标本汇集为1个汇集管（pooling）；如标本数不足8份，则用平衡液将液体补齐至1.2ml。

2.取出核酸萃取液、载体RNA和内标充分混匀。

3准备5ml冷冻离心管于试管架，标记，每管加入4.2mlLysis,10ulPoly（A）RNA,5ulIC,30ulBeads,1.2ml样品，混匀。

4.每5min混匀一次，室温30min。

5.按900ul/孔将混合液Mix加入反应盘L-1中，

6.将反应盘L-1底部固定上金属条（固定于反应盘第6和第12列处）后置于MeDiProSuperPureSystem-32机器上（使用前经紫外线灯照射20min），调用并执行程序“Lysis-4200”。

待机器第一次鸣叫时（暂停），取下反应盘L-1；将反应盘L-2固定上金属条后置于机器上，按“自动运行”让程序继续执行。

待机器再次鸣叫，程序结束（使用后紫外线灯照射20min）。

取下反应盘L-2卸取金属条，反应盘L-2的第6或第12列孔内的洗脱液即为PCR扩增反应用核酸模板。

7.将反应盘L-2置于磁力吸附架上靠磁，用移液器单孔或用八连排移液器吸取模板按40ul/test分配到已分装好扩增试剂的扩增反应盘或八连管中，覆膜或盖上盖子，经传递窗转移到扩增区。

8.3扩增检测区操作

步骤

温度

时间

循环

1

20℃

5分钟

1

2

42℃

35分钟

1

3

94℃

10分钟

1

4

94℃

10秒

45

55℃

15秒

65℃

45秒

注

65℃采集全部荧光信号

8.3.1将经传递窗传递过来的96孔PCR扩增板放入荧光PCR仪ABI7500，按照右图设定程序进行PCR扩增。

8.3.2扩增结束后将实验数据保存并进行结果判定。

判定条件如下：

质控品结果判定：

分析项目

内标

HBVDNA

HCVRNA

HIVRNA

备注

检测荧光

HEX

TAMRA

FAM

ROX

CY5

阴性质控品

Ct≤40

Ct≤40

Ct>45或无值

Ct>45或无值

Ct>45或无值

否则重测

阳性质控品

/

/

Ct≤45

Ct≤45

Ct≤45

否则重测

待测标本结果判定：

分析项目

内标

HBVDNA

HCVRNA

HIVRNA

结果判定

检测荧光

HEX

TAMRA

FAM

ROX

CY5

待测标本

Ct≤40

Ct≤40

Ct>45或无值

Ct>45或无值

Ct>45或无值

三项病毒核酸均为阴性

/

Ct≤40

Ct≤45

Ct>45或无值

Ct>45或无值

HBVDNA阳性

Ct≤40

/

Ct>45或无值

Ct≤45

Ct>45或无值

HCVRNA阳性

Ct≤40

/

Ct>45或无值

Ct>45或无值

Ct≤45

HIVRNA阳性

Ct>45或无值

Ct>45或无值

Ct>45或无值

Ct>45或无值

Ct>45或无值

所有结果重新测定

Ct>45或无值

/

Ct>45或无值

/

/

DNA结果重新测定

/

Ct>45或无值

/

Ct>45或无值

Ct>45或无值

RNA结果重新测定

备注：

“/”表示当其它条件满足时，该荧光通道结果可不做考虑。

1.采用合并检测的方式进行原始标本病毒的核酸检测。

合并检测为病毒核酸阴性反应，该汇集池中的标本三项病毒核酸阴性。

合并检测呈现病毒核酸阳性反应时对合并检测汇集池标本进行拆分检测，挑选出对应的病毒核酸阳性标本。

最后对筛出的阳性标本进行确认检测。

2.按照临床用血的要求，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒任何一项有潜在感染的可能时，该份标本应被剔除，视为不合格用血。

3.内标检测

标本测定结果如果为核酸阴性，则内标结果必须为阳性；否则标本的测定结果无效重新测定。

标本测定结果如果为核酸阳性，内标结果可以不做考虑。

8.3.3汇总结果并按《核酸实验室结果发布操作规程》发送报告。

8.3.5实验后续及维护：

实验结束后，将96孔PCR扩增板装入自封袋后转移至医疗垃圾暂存处以备高温高压处理，并清洁设备和实验室。

8.4全程如实填写各项试验记录。

8.5消毒与防污染措施的执行

8.5.1室内通风。

8.5.2使用75%酒精喷洒室内空间、生物安全柜操作台、扩增仪载架、STAR载架；擦拭核酸萃取仪工作仓、STAR台面。

8.5.3使用有效氯含量为500mg/L的消毒液擦拭地面、实验台面、物品表面和仪器表面。

8.5.4使用移动紫外灯照射（60-90cm）工作台面、器具一小时；固定紫外灯照射室内四小时。

8.5.5定期（每周）擦拭、消毒冰箱；定期消毒空调滤网。

9.相关文件

9.1《生物安全手册》

9.2《消毒液配制操作规程》

9.3《清洁与消毒控制程序》

9.4《紫外线灯标准操作规程》

9.5《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书》

9.6《核酸实验室试剂准备区实验记录》

9.7《核酸实验室标本制备区实验记录》

9.8《核酸实验室扩增及产物分析区实验记录》

9.9《核酸实验室MeDiProSuperPureSystem-32核酸提取仪操作规程》

9.10《核酸实验室荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程》

9.11《核酸实验室STAR全自动样品处理系统操作规程》

9.12《核酸实验室试验结果判定准则》

拟制：

审核：

批准：

批准日期：