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实验设计
(一)临床病例
1、某2岁患儿,突然发热38.5℃,伴有咳嗽、流鼻涕等感冒症状,手掌、脚掌部出现斑丘疹和疱疹,临床初步诊断为手足口病。
请你设计实验进行病毒的分离培养和鉴定,以确定该病原体为何种病毒?
2、某女性患者,40岁。
尿频、尿急、尿痛、小腹不适。
临床诊断为尿路感染?
(尿道炎?
)。
采集患者清洁中段尿标本。
请进行尿细菌学检查、鉴定及药敏实验。
3、5岁患儿,食用某种不洁食物后,发热39℃,伴有恶心、呕吐、腹痛、腹泻、里急后重,稀便转成脓血粘液便,每日数十次,量少,失水不显著。
临床初步诊断为急性细菌性痢疾。
请你设计实验进行细菌的分离培养、鉴定及药敏实验。
4、某女性患者,32岁,已婚。
外阴骚痒、灼痛,伴有尿频、尿痛及性交痛,白带增多,稠厚呈豆渣样。
临床诊断:
真菌性阴道炎。
采集阴道分泌物标本。
请进行阴道分泌物病原性真菌分离、鉴定;致病性检测及药敏试验。
5、患儿,男,3岁。
三天前开始发热,最高38.8℃。
伴有咽痛,头痛,呕吐等全身症状。
一天前全身皮肤发红,出现皮疹。
查体见咽部充血及点状出血,全身典型皮疹,体温38.5℃。
近二周幼儿园有多个相似病例出现。
临床初步诊断为猩红热。
采集患儿咽拭子标本,请设计实验进行病原菌分离、鉴定、致病力分析及药敏实验。
(分型不同菌群致病性及发病率耐药性及耐药机理)
6、患者,男性,35岁。
近一周常感乏力、体温升高38.0℃+、厌食、恶心、呕吐等,小便深黄,大便灰白,皮肤巩膜黄染,肝脾肿大,肝区扣痛。
肝功检测转氨酶升高。
临床诊断为甲型肝炎。
请设计实验进行病原学诊断。
附件:
病原生物学实验设计论文
论文题目:
(一般20字以内,加粗3号宋体字)
指导老师:
王笑峰张文卿
小组成员:
刘贝200970801042
初元200970801031
孙圣200970801047
刘强200970801012
班级:
临床七年制二班&一班
2010年11月17日
研究内容摘要(200字以内)
【目的】确诊该患儿是否为急性细菌性痢疾,并分析其药物敏感性,以辅助临床医
生准确快速诊断并指导临床合理用药。
【方法】取该患儿的粪便进行粪便的分离培
养,通过生化反应和血清凝集试验等方法来鉴定该菌是否为志贺菌;采用K-B琼
脂纸片扩散法进行药敏试验,所选药物包括:
氨苄西林、庆大霉素、诺氟沙星、
环丙沙星、头孢噻肟等。
【预期结果】该患儿为急性细菌性痢疾,该菌对诺氟沙星
以及环丙沙星敏感性较强。
关键词(3-5个):
痢疾志贺菌分离培养鉴定药敏试验
一、选题的目的和意义(主要说明:
进行研究的必要性、预期达到的目的、
实际应用价值和学术意义)(600字以内)
在我国,志贺菌引起细菌性痢疾仍然是仅次于病毒性肝
炎和结核病的重要的法定传染病,而急性菌痢是细菌性痢疾
的常见临床类型[圆,猿]。
志贺菌分为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、
鲍氏志贺菌、宋内志贺菌源种血清型,欧美国家目前以宋内志
贺菌为主,而我国多数地区主要流行福氏志贺菌
二、国内研究现状:
(1000字以内)
AshkenaziⅢ等对以色列1998-2000年分离的志贺菌与1991—1992年分离的进行对比
发现,四环素的耐药率显著增加,从23%增加到87%,氨苄西林的耐药率高达85%,对喹诺
酮类耐药率达0.5—2%。
Wilson“1等研究发现,在尼泊尔西部分离的83株志贺菌中,67株
(80.7%)产生耐药性,62株(74.7%)对两种或多种抗菌药物耐药。
土耳其Ozmert‘31等
报道,志贺菌多重耐药的发生率为24%,最常见的多重耐药为甲氧苄啶一磺胺甲基异恶唑
和氨苄西林。
Tanejan’等报道,在印度志贺菌的耐药率高达70%。
在国内方面,李红玉‘51
等对广州126株志贺菌对8种抗菌药物的药敏试验结果表明,对氨苄西林及复方新诺明耐
药率较高达90.0%以上,对阿莫西林/棒酸、氨曲南的耐药率次之分别为72.2%和69.8%;
近年来,随着抗生素大量广泛应用于治疗菌痢,临床上多重耐药志贺菌株出现的频率越来越高,不仅耐药产牛速度快、耐药率高,而且耐药范围gu广,对细菌性痢疾的防治和细菌耐药性的传播都带来了新的挑战和影响.在中国感染性腹泻病原谱.,深入系统地了解志贺菌耐药现状和耐药机制及如何解决耐药性问题已成为目前细菌性痢疾的主要研究热点。
对目前在临床上大量使用的喹喏酮类药物的耐药率已达到40%以上,不同地区志贺菌属细菌的耐药谱虽不尽相同,但共同的规律是多重耐药株增多,且都针对于该地区该时期的常用抗生素,
大量研究表明,R质粒介导的多重耐药性是志
贺菌对四环素、氯霉素和氨苄青霉素等多种药物耐
药的原因。
近年来随着分子生物学技术的发展,人
们从另外一些角度认识志贺菌的多重耐药性,那就
是主动外排系统acrAB_tolC。
acrAB蛋白的内膜转
运子acrB和外膜孔道tolC由acrA连接,因而称
acrA为连接蛋白。
主动外排系统是细菌产生多重
耐药性的主要原因。
在大肠埃希菌中已发现有多种
大肠埃希菌主动外排系统acrAB-tolC调控机
制十分复杂,主要受a七rR抑制子、marRAB操纵子
和soxRS操纵子等调节。
研究发现志贺菌结构基因acrABt01C突变株与未突变株其mRNA表达水
平差异无统计学意义,表明acrAB—tolC基因本身突
变不影响表达改变,可能是受上述多种耐药操纵子
调控的结果。
具体的调控机制有待于进一步研究。
3耐药性相关基因
在对志贺菌多药外输作用的研究,国内外文献仅
限于多药外输作用有关的相关基因结构的研究。
在
福氏志贺菌2a中,与药物外输作用相关的蛋白是存
在的,如存在与药物外输调节作用的marA蛋白,其
基因marA位于染色体l611403bp~16ll843bp
之间,推测的蛋白氨基酸序列与在大肠埃希菌中完
全同源。
marA可能为志贺菌对多抗生素和过氧化
物等耐药性的启动子激动剂,是目前所知的与多药
外输作用有关的最主要的调节蛋白。
其次,福氏志
贺菌2a中存在有关多药外输蛋白有acrA、acrB,其
对应基因位于细菌染色体上426775bp~
431923bp之间。
基因hdeA位于染色体
365221lbp~3652780bp之间,hdeA在大肠埃
希菌中编码一个与抗酸有关的蛋白。
在福氏志贺菌
2a中,同时存在第3种与药物外输有关的基因
tolB、tolA、tolQ,在染色体上位于587214bp~
4319965bp之间口引。
以上基因推测的氨基酸编码序列除调节蛋白marA与大肠埃希菌完全同源外,
其他3种外膜输出蛋白与其他细菌的同源性仅为
80%左右。
上述与多药外输作用相关的基因存在的
证据表明,在志贺菌中存在多药外输机制,但这种机
制是如何发生的,目前还没有相关研究证据。
大肠埃希菌AcrAB—tolC可介导多种药物的外
输,如果使该系统失活,大肠埃希菌即从多重耐药状
态变为相对敏感状态,因而研制出的有效抑制剂能
在相当程度上克服其耐药性。
大肠埃希菌的RN肛
type转运子的抑制剂一MC一207,110(苯丙氨酸一精氨
酸一8一萘胺),可显著抑制临床常见的具多重耐药外
排系统的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、
革兰氏阴性菌等耐药菌比0|。
但志贺菌AcrAB系统
的抑制剂尚未见报道。
4.4开发不使用抗茵药物治疗感染的治疗策略
主要包括开发传统抗菌药以外的药物,通过信
号标记诱导的大量突变及障碍码分辨系统,开发这
些高度特异靶位的药物比传统的抗菌药物具有更窄
的作用谱;构建工程DNA质粒可以破坏病原菌灭
活抗菌药物的基因和破坏负责毒力基因的研究工作
正在进行中。
人类天然抵抗感染防线的一部分的抗
微生物肽正在研究中,包括protegrin爪蟾抗菌肽、
防御素、鲨胺和histaninV等[2¨。
Zhenghezi
目前,国内外对整合子的研究很多,大多集中在
铜绿假单胞菌及大肠埃希菌。
近几年,国内外研究
表明,整合子系统与志贺菌耐药性也有密切关联。
平传播。
因此检测整合子系统从而快速准确获得志贺
菌多重耐药的信息,可以为阐明细菌耐药机制、减少
细菌耐药发生提供新的思路。
效大为降低。
这些多重耐药性几乎全部由耐药性质
粒(R因子)所引起,R因子具有自主复制能力,其
耐药机制是细菌产生或加强破坏抗菌药物的酶系。
可在体内外或细菌种内或种外进行传递。
由于多重
耐药性均由R质粒携带,通过接合转移、转化或转
导而形成耐药性传递。
由于细菌能接受和传递耐药
性基因,从而获得了同时对多种不同抗生素的耐药
性,减少了对抗生素联合应用的疗效[7j。
因此,临
床上应依据肠道菌群的变迁和耐药性的检测合理选
择抗生素。
产生外毒素。
目前,我国的菌痢多由福氏志贺菌引起,宋
内和鲍氏志贺菌有增多趋势。
所有志贺菌都可引起普通型
和中毒型痢疾,并可引起溶血尿毒综合征、神志不清和中
毒性休克等“。
志贺菌被发现至今已有百余年历史,随着微生物实验技
术的发展,志贺菌的检测鉴定技术也不断完善,大致可以分
为如下几类方法:
培养与生化鉴定,免疫学鉴定,毒素检测
以及分子生物学检测。
分离培养与生化鉴定优点是直观、准确,基本不会出现
假阳性结果。
主要包括传统手工鉴定和数码鉴定。
这些技术对实验室的设备和实验人员
的知识技术水平要求不高,易于推广,因此培养与鉴定是目
前所有实验室都在使用的常规技术手段。
但是,常规检测从
取得标本.经过多次培养、分纯和生化鉴定,到得H{结果最
快也需要2~3d。
这对于志贺菌感染的患者,尤其包括很多
旅行患者来说,显然不刹于临床及时诊断与治疗。
尤志贺菌对宿主的致病作用是依赖其毒索产生的。
志贺菌
的毒素包括内毒素和外毒素。
内毒素是志贺菌外膜中的脂多
糖成分,全部血清型的菌株都含有内毒素,其主要作用是提
高肠黏膜的通透性,破坏肠黏膜形成炎症和溃疡,使患者呈
现典型的黏液脓血便。
内毒索还作用于肠壁植物神经系统.
使肠功能发生紊乱,肠蠕动失调和痉挛.尤其直肠括约肌痉
挛最为明显,因而出现腹痛和里急后重等症状。
志贺菌内毒
素中含有的特异性多糖成分就是菌体的O抗原。
目前,检测
志贺菌体O抗原的血清凝集试验已经成为志贺菌检测分型鉴
定的标准方法.这项技术要求不高,检测成本也较低,适于
各级实验室采用。
也有报道采用PCR方法检测志贺菌内毒素,
但不如ELISA法便于操作。
志贺菌外毒紊(shlgatoxin,ST)因能使Veto细胞发生病
变也称Veto毒寨(vT).主要有肠毒性、细胞毒性和神经毒
性作用⋯。
志贺菌外毒素包括st-I和sr-Ⅱ两种,其成分为
蛋白质,因而一般可以采用ELISA方法检测。
志贺外毒素ST-
和St-Ⅱ分另q是由位于染色体上的sd和se/1,编码”J,可通
过PCR方法检测这些基因片段”J。
Vargas等人采用了分别检测编码ST-I和ST-Ⅱ两个亚单位A和B的基因片段setlA和
setlB∞j。
,但志贺菌外毒素只有部分菌株能产生,每种产毒株
也并非携带全部毒素,田而志贺菌外毒素检测只能作为型别
鉴定后产毒株的确证实验,而不能用于菌种鉴定。
志贺菌毒素的检测还可进行体外实验和体内实验。
体外
实验包括细胞实验和ELISA实验。
目前检测志贺菌毒素的细
胞实验是Veto细胞或Hc碑细胞染毒实验,通过观察细胞病
变来判断sr是否存在”⋯。
细胞实验是检测志嘏菌毒素的标准
方法,准确度高,但技术要求也较高,不易推广普及。
杳|j比
较而言ELBA方法更便于采用,但准确度不如细胞实验。
志
贺菌毒素检测的体内实验是豚鼠角膜实验,是国家标准检测
方法,可咀观察计毒素对机体的直接致病作用,优点是直
观,但实验成本和技术要求比细胞实验更高“⋯。
3分子生物学检测
志贺菌检测的分子生物学技术主要包括:
①常规PCR检
测;②real-tinmPC,R;③质粒酶切图谱;④棱糖体分型;
@脉冲场凝艘电泳(PFGE);@基因探针杂交与基因芯片。
3.5脉冲场凝胺电泳(PFGE)
PFGE是目前进行志贺菌流行病学分析最常片j的方法之
一,电被认为是进行细菌分型最有效的技术方法¨“。
PFGE主
要是利用限制性内切酶识别核酸序列上的特异位点,将整个
细菌染色体组裂解为若干片段,通过脉冲场电泳分离成像,
经过不同图型问比对从而分析同一菌种亚型的不同菌株来源
及其变异特点。
总体上PFGE与PPA基本原理相同,但在菌
株分型1-比后者更有效力”’1⋯。
目前用于志磺菌PFGE检测的
限制性内切酶主要有4种:
XbaI、蹄I、NotI和跏I。
从
以往的实验数据来看,岛卵I的酶切片段都是小于50kb的小
片段,PFGE的电泳图片不理想,不易分析,因此目前大多使
用前三种酶。
最近的一些资料表明,通过采用PFGE技术已经
成功将同一血清型的志贺菌株分为若干亚型。
我国台湾省的
一些研究人员的实验数据表明,XbaI可以将志贺菌DNA组
酶切成17~19个片段,片段长度为32~436kb;sfiI的酶切
片段为20~23个,长度为32~436kb;NotI的酶切片段为
12~14个,长度为32~727kb。
研究人员通过综合使用三种酶
发现.同一地点采集到的志贺菌株,相同的血清型都有相同
的PPGE图形,而不同来源的菌株,相同的血清型也有不同的PFGE结果婚J。
因此,在细菌性痢疾暴发时期,采用PFGE技
术可以分析出不同患者标本分离到菌株的亲缘关系,有助于
流行病学调查和追踪传染源。
目前国内采用PFGE技术对志贺
菌的研究还很少,大部分资料都是国外的文献报道,这些与
国内的菌株核酸型别及变异特点毕竟还有一定差别。
这就需
要更多的实验数据以建立国内以及各地区志贺菌DNA的PFGE
数据库,在今后的实验结果分析中,可以与已知的数据库进
行比对,使结果分析更便捷迅速18.1s]。
相关基因趔¨邺。
相比较而言,基因探针与芯片技术比PFGE
在分析DNA核酸序列点突变方面更直接、更准确,但电窖易
出现似阳性。
,在检测时间上,基因探针与芯片技术是在提取
核酸并进行PcR扩增后进行分子杂交,比普通PCR时间更
长。
比较适用于腹泻暴发后的流行病学分析与同顾,而不利
于应急处理期fsj的快速榆测鉴定。
同时,使用芯片技术成本
较高,目前在国内不易推广。
2.5随机扩增多态性DNA(RAPD)PAPD技术是以PCR为摹础,利用人工合成的随机序列寡核苷酸作引
物,以生物的皋因组DNA为模板,进行PCR扩增,产生不连续的DNA产物,通过琼脂糖凝胶电泳来
检测DNA序列的多态性。
Li等¨毗tl-JPCR从纯培养和粪便标木巾检测出沙门氏菌、痢疾杆菌及大肠埃
希菌0157:
H7。
肠道细菌的总引物为uidA,它不仅存在大肠埃希菌的核酸卜,还存在于沙门氏菌、
痢疾杆菌的珐因中。
痢疾杆菌的引物为ipaH,存在于质粒和染色体卜,编码侵袭质粒相关抗原。
沙
门氏菌的引物为16SrRNA序列。
大肠埃希菌0157:
H7的引物为eaeA基因。
随机扩增多态性DNA选择
上述5对随机引物。
检测系统包括普通PCR,半巢氏PCR及随机扩增多态性DNA。
此方法可以从3-50CFU
中检测沙门氏菌、痢疾杆菌及大肠埃希菌0157:
H7,敏感性{艮高,而儿检测时问只需4h,方法简单
快速,可以作为~种常规方法『fj于临床标本的病原微生物检测。
RAPD技术的优点是:
1)模板DNA用量少;2)标记数量极为丰富:
3)安全、经济、快捷、简单易行。
该
技术可广泛川于细菌种群的分类鉴定、遗传连锁蚓谱的建立、基因定位、杂种优势分析和标记辅助选择。
缺点是:
1)RAPD标记是显件的,常不能区分纯合子与杂合子;2)易产生假带及非亲本带。
可通过严格控
制试验条件来减轻以上情况对试验结果的影响。
2.6扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)基因组DNA经限制性
内切酶酶切后,产生分子质量大小不同的限制性片段,扩增产物经放射性同位素标记后进行聚丙烯
酰胺凝胶电泳分离,根据凝胶上的DNA指纹分析其多态性。
Sirisriro等¨1。
用AFLP鉴定230株福氏
和宋内氏痢疾杆菌的遗传亲缘关系。
福氏痢疾杆菌群根据血清型分型,每种血清型中相似性达80%~
100%的菌株可以根据hFLP区分鉴定。
,
AFLP是RFLP和RAPD两种分子技术的结合,具有标记多态性强、准确件高、重复性好以及可用于没
有任何分子生物学研究基础的物种等优点,因此。
该技术在高密度遗传图谱的构建、基因定位、遗传多
样性检测、分子标记辅助育种、系统分类等研究领域得到J“泛应用。
缺点是操作时问长,步骤多,对实
验技能及仪器设备的精密度要求很高。
2.7脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)PFGE是1种非常有效的分子分型方法,
以重复性好,分辨力强而被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”。
Noda等u副使用扩增片段长度
多态性(AFLP)、分子流行病学分型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)等3种方法对51株痢疾杆菌分离株
进行了鉴定,以期比较3种方法的分型能力、可重复性、鉴别力,解释的合理性和实用性。
虽然扩
增片段长度多态性(AFLP)在细菌的分型能力、鉴别力一卜优于脉冲场凝胶电泳,但方法的可重复性
及解释的合理忡稍差。
在重复性试验中,扩增片段长度多态性(AFLP)3次试验结果的一致性为81.9%~
90.5%,而脉冲场凝胶电泳则为92.3%~100%。
扩增片段长度多态性(AFLP)用于细菌件痢疾基囚分
型的优点是分型能力强,鉴别力强,所以在种系树的细分上有优势;但由于方法的可重复性较差,
在对细菌性痢疾暴发流行或散发病例进行检测时,其分子分型效果不及脉冲场凝胶电泳。
脉冲场凝胶电泳具有重复性好、分辨率高。
副、结果稳定、易于标准化等优点,能在细菌摹因组很庞
大的情况下,尽可能反映较多的变异信息。
其局限和不足是:
1)操作者需要有较高的技术水平:
2)不
能同时优化胶的每个部分的条带分布;3)结果得到的是条带,而不是序列;4)不能确切地认为相同大
小的条带就是相同的DNA月。
段。
脉冲场凝胶电泳分析对于大小相似的”段分辨率不高’¨1,一个酶切位点
的变化可能引起不止l条带的变化。
PFGE得到的亲缘关系只能起到指导作用,而不是真j下意义上的种系
发生量度。
流行病学结论应该结合流行病学调企结果。
“和其他分子分型资料¨6’川才能最终确定疾病的传
染源。
霉素、头孢噻肟的敏感率。
痢疾志贺菌对
多种药物的耐药性主要由耐药质粒控制[]
,耐药,也可将耐药质粒传递给志贺菌使之耐药。
因此由于四环素、萘啶酸、复方磺胺甲唑等抗菌
药物的使用,大量的敏感菌被抑制杀灭后,耐药菌
株形成优势,导致耐药感染;同时由于耐药质粒的
传递,造成大量耐药菌株的产生。
但需说明的是:
质粒不介导对喹诺酮类药物的耐药性,喹诺酮
类药物的耐药性主要和细菌旋转酶
基因的点突变有关[]
。
药质粒在菌群之间可以互相传递,肠道的正常菌
将福氏志贺菌和宋氏志贺菌的耐药结果进行
比较,宋氏志贺菌的耐药结果比福氏志贺菌好,前
者对诺氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、氯霉素的耐
药率较后者低。
宋氏志贺菌作为引起细菌性痢疾
的一种血清型,以往其引起病变的情况较少,因此
将诺氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、氯霉素的耐药
质粒传给宋氏志贺菌的机会较少,其耐药率也较
福氏低。
3.2_药敏结果
药敏结果显示,除氨苄青霉素、复方磺胺嘧定耐药性较高
外不宜选取,其它药物均可。
喹诺酮类药物治疗肠道菌感染
有价廉﹑用药方便及不良反应少等优点,但需特别注意其耐
药性的增长,尤其福氏志贺菌更为严重,同类菌株对药物的敏
感水平大致相近,不同菌型的志贺菌,其耐药性也存在差
异[4]。
同时不同喹诺酮类药物间存在交叉耐药,遇有一种喹
诺酮类药物疗效不理想,更换抗菌药物不宜用同类药物。
因
此,临床医师在使用抗菌药前要常规送检志贺菌和沙门菌的
培养与药敏检测,即使经验用药也需不断参考耐药谱的变化,
提倡合理使用抗生素,这样不仅可提高诊断的准确性,也可提
高疗效,防止耐药株的产生。
细菌性腹泻,临床特征近几年并
无大的改变,但血清型的变化较大,防治仍不容忽视,需引起
有关部门的高度关注。
2_5_多重耐药情况
77株志贺菌均为多重耐药菌。
以6种耐药为主,占
48_05%,最多者对7种抗生素耐药。
6株7重耐药菌,5株为
F2a型,1株为宋内_型。
3_讨论
本文结果显示,4个菌痢监测地区的志贺菌菌群分布与以
往文献报告不同[1],流行菌群以宋内菌为主,福氏菌次之,而
福氏菌亚型则以F2a为多,这一结果与国内其它地区报道的结
果相同[2]。
此外菌群分布提示,各地流行菌群差异较大,平坝
县均为福氏菌,桐梓县均为宋内菌,而开阳和紫云县则是两种
菌共存。
两种菌群的流行株都可引起菌痢的暴发疫情。
各地应
根据本地区菌型流行情况,加强监测和预警,及时采取防控措
施,防止菌痢暴发流行。
药敏试验结果显示,77株志贺菌对10种抗生素已有不同
程度的耐药,耐药率达6_49%~100_00%,且已产生多重耐药
现象,提示贵州志贺菌耐药情况已较为严重,尤其是对第三代
喹诺酮类药物环丙沙星已开始产生耐药。
这一情况应引起有关
部门的高度重视,临床治疗应加强耐药性监测。
不同地区的流
行菌株对抗生素耐药程度有差异,可能与该地区用药习惯有
关,因此各地临床用药应结合本地流行株的耐药情况选择使用
敏感性高的药物,且应加强抗生素的使用管理,避免滥用,减
少耐药性产生。
参_考_文_献
[1]王定明,张玉琼,李世俊,等_贵州省痢疾杆菌菌型分布及耐药
性变迁动态[J]_贵州医药,1991,15
(2):
114-117_
[2]徐志涛,刘恒彩,马文军,等_2007年北京市昌平区细菌性痢疾
菌群分布和耐药谱变化分析[J]_疾病监测,2008,23(6):
347-349_
(收稿日期:
2010-06-07)
三、拟采取的技术路线及实验方案(1000字以内)
1、粪便标本取样及志贺菌的分离培养
(1)取该患儿自然排出的粪便,用无菌棉花签挑取粪便。
(2)立即接种肠道选择性培养基SS培养基第一区,接种环灭菌后分三区划线,每
区接触上一区的接种线6-8条,划线完毕后置普通孵箱,37℃培养24小时。
2、志贺菌鉴定
挑选SS培养基上无色透明或半透明可疑菌落,接种于克氏双糖铁培养基(KIA)
上,置普通孵箱,35℃培养24小时,符合志贺菌基本特性,KIA上为K/A+/--,
不分解乳糖、分解葡萄糖产酸或产少量气体、不产硫化氢,斜面为黄色,底层为
红色,然后做进一步生化鉴定
和血清学凝集试验。
2.1生化鉴定
志贺菌符合肠杆菌科细菌基本特性,即氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。
将氧化酶试
验为阴性者将待检细菌接种于MIU、MR、硝酸盐还原试验、枸橼酸盐利用试验
鉴定试验结果判断:
(1)MIU:
穿刺线周围扩散生长为动力阳性。
沿管壁加吲哚试剂稍待片刻即观察液
面上变红为吲哚阳性。
培养基变红为尿素阳性。
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- 实验设计