茶多糖指纹药动学研究蔡剑雄.docx
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茶多糖指纹药动学研究蔡剑雄
研究生选题报告书
选题题目茶多糖指纹药动学研究
研究生姓名蔡剑雄
学号132200821
导师姓名魏新林职称教授
所属院(系)生命与环境科学学院
专业生物化学与分子生物学
研究方向天然产物化学
选题报告时间:
2015年7月9日
二O一五年七月九日
说明
1.选题报告要用计算机打印或用黑色钢笔逐栏填写,要求字迹清晰,文句通顺。
2.选题报告所列各栏内容要详细填写、要求重点突出。
3.选题报告于第三学期开始,最迟不能超过第四学期末完成。
4.选题报告是中期考核筛选工作的一部份,选题报告不合格者不得进入论文工作阶段。
注:
1.一至三的内容可打印加页(空表可在校园网上下载),四至八的内容,用碳素墨水填写在表内。
2.研究生将选题报告完成后,博士生加上《研究生考核登记表》,硕士生加上《研究生考核登记表》和《研究生实践能力考核表》一通交到研究生处培养办审核,审核通过后方可进入撰写论文阶段。
研究生选题报告书
一、文献查阅报告:
(附所阅读的主要文献至少40篇以上)
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[13]孙玮.海洋硫酸多糖916对洛伐他汀在大鼠体内外药代动力学影响[D].中国海洋大学,2008.
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[20]朱春红,万盟,李维等.黄精多糖对阿托伐他汀在大鼠体内药代动力学的影响[J].中国生化药物杂志,2014,(5):
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[23]刘畅.海洋硫酸多糖916对辛伐他汀在大鼠体内药代动力学的影响[D].中国海洋大学,2008.
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[26]李珂.当归多糖铁原料药在动物体内的药物动力学研究及其固体分散体肠溶胶囊的研制[D].华中科技大学,2008.
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[34]易延逵,王琼,张璐等.“指纹药动学”的构思与研究[J].中草药,2014,45(13):
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二、和选题相关的调研报告:
(调研时间、地点、单位及主要收获等)
茶多糖(TeaPolysaccharides,TPS)系茶叶中一类由糖类、蛋白质、果胶等物质组成杂多糖复合物,其广泛药理活性且低毒,以降血糖功效尤为突出,是一种很有开发前景的重要天然资源。
许多糖尿病动物活体试验表明,茶多糖能明显缓解糖尿病小鼠“三多一少”症状,改善小鼠的糖耐量,降低其空腹血糖,并存在剂量-反应关系。
中国式摔跤女运动员人体试验亦表明,茶多糖可通过增强抗氧化能力,减轻心肌氧化应激损伤;改善血液流变性,提高心肌血液有效灌流,改善微循环有效灌注。
虽然众多学者已从抗氧化机制、糖代谢酶调控机制、肠道糖代谢酶等多层次机制和分子、细胞、动物等多实验体系探讨茶多糖防治、延缓糖尿病进展,但是关于茶多糖被口服后,其胃肠道吸收变化,组织分布特性,体内代谢特点以及排泄等规律却鲜有报道。
为了正确评价茶多糖在人体内的疗效与安全性和开发富含多糖的功能茶制品,就必须对其进行体内的吸收代谢过程的研究,建立相应的科学评价方法,揭示其体内的吸收、分布、代谢和排泄的规律。
目前,对茶多糖的研究在提取、分离纯化、加工工艺、一级结构解析、药理活性等方面已做了大量研究工作,但对茶多糖的药代动力学(Pharmacokinetics,PK)研究较少,其主要原因如下:
1.由于茶多糖分子缺少生色基团和发色基团,导致其生物分析检测方法的建立十分困难,从而制约了茶多糖PK的研究。
2.茶多糖结构相当复杂,糖链庞大,构象繁杂,存在一定的分子量分布,除了一级结构(单糖组成、分子量、糖苷键类型和连接方式),其活性和动力学行为可能与报道较少的高级结构密切相关,导致茶多糖的分析方法与传统的单体化学药品大不相同,其检测难度大、需解决的问题多。
3.生物体内大量内源性相似多糖的干扰,目前尚缺乏特定的标准化的方法来定量检测多糖在体内的吸收分布。
4.此外,当化合物的理化参数满足下列任意两项时,化合物在小肠中的吸收就差:
(1).分子量大于500;
(2).氢键给体数大于5个;(3).氢键受体数大于10个;(4).logP值大于5.0。
而茶多糖分子量大、极性强,分子量几万到十几万KDa,可能导致胃肠道吸收差、生物利用度低,致使多糖血药浓度及其代谢产物在体液中浓度很低,为体内检测带来巨大难度。
多糖的生物分析方法是制约茶多糖PK研究的关键所在。
文献报道的测定方法有3类,具体如下:
1.预标记方法(pre-labelingmethod),灵敏度极高,但是衍生化可致多糖异构化、降解、构象改变,已有应用于银耳多糖(FITC-125I-预标记法)、葡聚糖(荧光素预标记法);2.生物测定法,易受敏感的生化反应的影响,又缺乏特异性,从而限制了它的广泛应用,已有应用于香菇多糖及其脂质体(鲎试剂显色基质法),聚甘酯片(aPTT法)。
3.柱后荧光衍生HPLC法,兼有分离与荧光检测,特异性高、灵敏度高,检测限可低至10~20ng,已有应用于兔血清中海洋硫酸多糖聚甘古酯、小鼠体内六味地黄多糖、大鼠体内麦冬多糖、大鼠血和尿中的DHG、小鼠血和尿中的硫酸软骨素。
柱后荧光衍生HPLC法是目前应用最广泛的测定生物样品中多糖类化合物的方法,其荧光衍生化试剂多为盐酸胍或2-氰基乙酰胺。
指纹药动学即指纹药物动力学,是借助于动力学原理和现代分析手段,通过定性、定量解析药物指纹图谱,将可知化学成分的指纹和体内代谢过程从数量上联系起来,研究药物活性成分、有效部位在体内吸收、分布、代谢、排泄的动态变化规律。
因此,借助指纹图谱技术进行药动学的研究,将更能真实地反映药物的整体性,从整体上探索天然产物在体内的变化情况,并可与药物疗效建立联系。
当前,药动学的指纹图谱的相关研究主要集中在血液指纹谱的研究方面,有学者采用高效液相色谱法制定了大黄的指纹图谱及大鼠ig后血清指纹图谱。
王喜军等利用RP-HPLC建立六味地黄丸及其类方给药后的大鼠血清色谱指纹图,发现出现了14个共有血中移行成分;另外,知柏地黄丸产生了5个血中移行成分,桂附地黄丸产生了2个特有血中移行成分。
因此,本研究采用高效凝胶渗透色谱HPGPC、高效液相色谱HPLC等色谱指纹技术和茶多糖耦合异硫氰酸荧光素FITC,对茶多糖口服后能否吸收,吸收后是否代谢,降解或代谢后的产物是否仍有药理活性,是否有组织特异性分布这一系列的药代动力学问题进行深入研究,为其进一步应用于医药、保健食品提供了重要依据,具有重要学术意义和经济意义。
三、选题报告(应包括以下内容):
1.所选课题的题目及课题来源;
茶多糖指纹药动学研究
2.课题研究的目的、意义;
目的是建立茶多糖生物体内的灵敏、可靠的定量分析方法,突破一直以来限制多糖大分子这类化合物体内药动学评价的瓶颈问题;利用血清指纹图谱技术从整体性上探讨茶多糖体内的药代动力学,揭示其体内的吸收、分布、代谢和排泄的规律,为开发富含多糖的功能茶制品提供科学依据。
3.和本课题有关的国内外研究现状分析,包括发展水平和存在的问题等;
茶多糖已被研究证实具有多种保健功效,如降血糖、降血脂、抗血栓、抗癌、抗辐射、增强机体免疫力等,其降血糖功效尤为突出,对糖尿病的防治作用成为众多学者关注的焦点。
但是茶多糖在体内的代谢途径尚不清楚。
而血液指纹图谱具有体现药物整体性特征的特点,较适合多成分复杂体系的研究,在中药药动学研究领域将有广阔的应用和发展前景。
因此,借助血清指纹图谱技术研究茶多糖在动物模型体内组织中的吸收、代谢、分布和排泄,并探讨了其在体内的代谢途径,也即是指纹药动学,整体上探索其在体内的变化情况,为茶多糖药代动力学的研究打下重要基础,为其进一步应用于医药、保健食品提供了重要依据,具有重要学术意义和经济意义。
4.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题;
研究目标:
应用血清指纹图谱表征茶多糖在模型和正常实验动物体内的吸收、分布、降解和排泄行为,探讨其茶多糖药代动力学行为以及模型与正常大鼠体内药动学规律与差异,以期为相关研究提供参考。
研究内容:
1.茶多糖生物样品定性定量分析检测研究
以异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光探针,考察不同pH、温度和反应时间对标记率的影响,确定反应最适条件,获得FITC取代度相对较低的TPS-FTC。
同时,采用凝胶渗透色谱HPGPC、荧光示踪、HPLC等方法检测标记前后茶多糖性质变化。
2.荧光标记茶多糖TPS-FTC体内外稳定性
通过凝胶渗透色谱HPGPC、荧光示踪、HPLC等方法,考察TPS-FTC在体内外的稳定性,确定其在体内的代谢形式及生物样品的保存条件。
3.建立TPS-FTC血浆、组织和尿粪的定量分析方法和方法学考察
利用荧光标记后的可发射荧光的性质,建立和完善TPS-FTC荧光定量分析用于茶多糖体内药动学研究的方法学,以适用于药代动力学研究大量样本的检测,所需检测的分别是大鼠血浆、尿液、粪便和组织(心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、骨骼肌、脂肪和卵巢等组织)。
4.茶多糖在模型与正常大鼠体内药动学比较研究
复制2型糖尿病大鼠模型,利用上述建立的的TPS-FTC荧光定量分析方法,研究茶多糖给药的正常和糖尿病大鼠的药动学特征,揭示茶多糖在大鼠体内的变化规律。
拟解决的关键问题
a)建立一种灵敏、可靠的茶多糖体内定性、定量分析方法:
进行体内药代动力学研究的前提是必须建立高灵敏可靠的定量分析方法;本研究拟定采用荧光柱前衍生化标记茶多糖,TPS-FITC偶联,考察取代度,同时对标记前后的茶多糖结构稳定性(HPGPC)进行研究。
b)建立各组织器官茶多糖定量分析方法
c)茶多糖体内代谢变化:
HPGPC分子量定性表征体内代谢变化。
5.拟采取的研究方法、技术路线;
5.1建立茶多糖荧光标记物定量分析方法
异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光免疫分析中常见的荧光探针之一,其荧光光量子产率高,有较好的光稳定性。
考虑作为本实验的荧光标记,共价偶联TPS,考察FITC取代度及FITC对TPS稳定性影响(理化性质);同时,测定标记反应的pH值和温度对茶多糖的标记率影响。
具体工作如下:
a)TPS-FTC取代度的测定
配置不同浓度FITC,采用加权最小二乘法回归运算建立FITC标准曲线;然后,考察TPS与FITC偶联标记反应的pH值和温度,结束后水复溶后乙醇沉淀,除去多余FITC;再以FITC标准曲线计算其对应的FITC量,以FITC的量计算TPS-FTC中FITC的取代度。
b)TPS-FTC高效凝胶渗透色谱指纹分析
以系列标准右旋糖酐为分子量标准品,分子量的对数LogMw对保留时间t,绘制标准曲线;其次,以峰位分子量、重均分子量和分子量分布宽度系数D为主要参考指标,以蒸发光散射检测器(EvaporativeLight-scatteringDetector)作为检测器,考察TPS标记前后稳定性变化情况。
c)TPS-FTC紫外可见光谱、荧光光谱分析
紫外可见光谱,荧光激发和发射光谱,从吸收峰的强度可计算FITC的标记率,判断最大激发波长与发射波长是否发生蓝移,荧光的stokes位移情况,减少测定过程中的散射干扰。
5.2荧光标记茶多糖TPS-FTC体内外稳定性试验
由于生物样品的测定通常不是在样品采集后立即进行,因此将样品保存于适当的条件下使样品在保存过程中稳定是非常重要的。
TPS-FTC稳定性考察是通过凝胶渗透色谱技术和荧光强度,分析体外不同条件下(PBS溶液、血浆、尿液)和体内(大鼠给药血浆、尿液、粪便)样品稳定性,以凝胶色谱峰的分子量分布范围、峰位、峰形、出峰时间的变化,用于鉴定、评价和确证TPS-FTC在不同条件下是否会发生明显降解,判断药物的代谢形式(原型或代谢物),可确定样品的保存方法。
5.3TPS-FTC大鼠体内药代动力学研究
经口给药TPS-FTC,采用乙腈沉淀蛋白方法进行血浆样品预处理,采用荧光检测和HPGPC指纹技术分析TPS-FTC特征与其化学成分体内分布血药浓度;不同时间眼眶取血,采用国内权威药物代谢动力学软件DAS2.0程序拟合房室模型,并计算药动学参数;鉴于药物在生物体不同的机能状态下,其药理作用和体内过程可能不同,研究TPS-FTC在病理情况下药动学特征与在正常动物体内特征的差异,对临床用药有指导意义。
5.4糖尿病大鼠模型制备
1次性ip小剂量链脲佐菌素STZ30mg/kg;3d后禁食12h,尾静脉采血,用血糖仪测定空腹血糖(FBG)值。
以11.1mmol/L≤FBG值<33.3mmol/L为标准,确定糖尿病造模成功大鼠。
6.预期的研究成果和创新点;
6.1预期研究成果
1)发表高水平学术论文1~2篇
2)建立一种茶多糖生物样品中高灵敏度定量和定性检测方法
3)探明茶多糖在模型、正常大鼠体内代谢分布的规律
6.2创新点
1)制备一种TPS药代动力学的重要工具——TPS-FTC。
以FITC为荧光探针,控制其相对较低的取代度,减少对茶多糖的理化性质和生物学功能,实现对茶多糖的高灵敏度检测。
2)与天然的生物碱、苷类、内酯等活性成分相比,茶多糖体内过程研究鲜有报道,已成为茶多糖深层次开发利用的技术瓶颈。
茶多糖PK研究对揭示其体内作用机制、指导功能产品开发、制定改性及应用方案等均具有重要现实意义。
7.研究进度安排
2015年7月-9月茶多糖荧光标记与稳定性试验
2015年9月-11月实验动物造模,茶多糖各组织器官方法学建立
2015年11月-2016年5月茶多糖体内药动学研究
四、指导教师对选题报告的意见:
当前,茶多糖的提取纯化及功效评价已相对成熟,且在一级结构解析、构效关系等方面也取得了大量研究成果。
然而相比其他功能小分子,茶多糖的PK研究却显得十分薄弱,制约了其相应产品的开发和应用。
该研究以指纹图谱技术研究茶多糖药动学行为,研究其体内定量和定性检测方法,同时对比模型和正常动物在药动学行为差异性,对探明茶多糖体内作用机制具有重要意义。
茶多糖指纹药动学的选题新颖,方案可行,前期调研稳固,同意开题。
指导教师签名:
年月日
选题报告的时间及参加报告会的考核小组人员名单(副教授以上职称者不少于3人,此栏由导师填写):
举行报告会时间:
地点:
参加人员:
组长:
职称:
(导师不能担任组长)
成员:
职称:
成员:
职称:
成员:
职称:
成员:
职称:
成员:
职称:
五、考核小组对选题报告的评语及对选题的意见:
选题报告考查成绩:
(记优、良、中、及格、不及格)
考核小组组长签名:
年月日
六、学科带头人意见:
学科带头人签名:
年月日
七、学院(系)备案时间:
教学秘书:
年月日
学院(盖章)
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