植物基因组DNA的提取及其定性定量分析研究报告.docx
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植物基因组DNA的提取及其定性定量分析研究报告
《分子生物学》实验报告
实验一植物基因组DNA地提取及其定性、定量分析
【实验目地】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析.b5E2R。
【实验原理】
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(大于0.7MNaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来.利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞.然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提地方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA.p1Ean。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段地常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质地多孔支持介质(琼脂糖凝胶)地样品孔中,并置于静电场上.DNA分子在高于等电点地pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.由于糖-磷酸骨架在结构上地重复性质,相同数量地双链DNA几乎具有等量地净电荷,因此,在一定地电场强度下,DNA分子地迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身地大小和构型.DNA分子地迁移速度与相对分子质量地对数值成反比关系,分子量小地DNA分子比分子量大地DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离.凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同地DNA分子,超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快,其次为线状DNA(LDNA),最慢地为开环质粒DNA(ocDNA).DXDiT。
核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环地共轭双键,在260nm波长处有特异地紫外吸收峰,其吸收强度与核酸地浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础.1OD260相当于dsDNA50μg/mL,ssDNA33μg/mL和ssRNA40μg/mL.可以此来计算核酸样品地浓度.紫外分光光度法不但能确定核酸地浓度,还可通过测定260nm和280nm地紫外线吸收值地比值(A260/A280)估计核酸地纯度,若DNA地A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染.RTCrp。
【仪器、材料与试剂】
一、仪器及耗材
离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL量程各一支)、100mL或250mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5mLEP管、PE手套和乳胶手套.5PCzV。
二、药品
三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料.jLBHr。
三、试剂
1.2×CTABbuffer【1】
2.70%乙醇【2】
3.RNaseA(天根)【3】
4.0.5×TBE缓冲液(工作浓度)【4】
5.6×loadingbuffer【5】
6.核酸染料(赛百盛)
7.DNAmarkerDL2000(Takara)
8.酚/氯仿(1:
1,V/V)【6】
【实验步骤】
1.取约100mg新鲜地拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管,在液氮冷冻条件下研磨成粉末状.
2.加入0.6mL2×CTAB提取液(用前加入0.2﹪地巯基乙醇),混匀,65℃水浴30min,每10min颠倒混匀一次.xHAQX。
3.取出离心管,冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液,混匀.
4.11,500rpm室温离心8min(若没离好可重复一次).
5.将上清液(约400μL)转移到另一新地1.5mL离心管中.
6.加入与上清等体积地氯仿,混匀,11,500rpm离心8min,取上清(约350μL).
7.加入600μL无水乙醇,上下颠倒混匀,-80℃放置30min.
8.4℃,15,800rpm离心20min,弃上清.
9.1mL70%乙醇(预冷)洗涤沉淀2次,上下颠倒几次,不能vortex,7,000g离心3min,弃上清,风干.LDAYt。
10.加入30μL无菌水(含20μg/mLRNaseA),37℃溶解DNA30min.
11.取5μLDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测:
(1)制备琼脂糖凝胶
称取0.3g琼脂糖,放入三角瓶中,加入30mL0.5×TBE缓冲液,置微波炉中加热至完全熔化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液.Zzz6Z。
(2)胶板地制备
①取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽地两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙),形成一个模具.dvzfv。
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并在固定位置放好样品梳子.
③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时,加入核酸染料1.5μL,摇匀,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀地胶面(注意不要形成气泡).rqyn1。
④室温下静置直至凝胶完全凝固(室温下30-45min),垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.Emxvx。
⑤加入0.5×TBE电泳缓冲液至电泳槽中,使缓冲液没过胶面约1mm.
(3)加样
在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液地最终稀释倍数应不小于1×.用10μL微量移液器分别将样品加入胶板地样品小槽内,将DNAmarker分别加至样品孔地左侧和右侧孔内.每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围地凝胶面(注意:
加样前要先记下加样地顺序).SixE2。
(4)电泳
①接通电泳槽与电泳仪地电源,DNA片段从负极(黑色插头)向正极(红色插头)移动).DNA地迁移速度与电压成正比,但电压升高使琼脂糖凝胶地有效分离范围降低,因此,最高电压不超过5V/cm.6ewMy。
②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳.
③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中地带(戴手套操作),采用凝胶成像系统拍照保存.
12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度:
(1)用0.1×TE对待测DNA样品按1:
20或合适地倍数稀释.
(2)开机,仪器会自动对光路及分析软件进行检测,待显示屏上出现“instrumentReady”时,进入核酸测定窗口.kavU4。
(3)调零.先用0.1×TE缓冲液注入样品杯,放入样品槽,关闭盖板.点击“setref”键,仪器自动校正零点.将样品槽内地样品杯取出,换上待测样品.y6v3A。
(4)吸70μL已稀释地DNA样品转入石英样品杯,放入样品槽,关闭盖板.如果样品很少,可以用5-7μL地石英样品杯.点击“enter”键,仪器即进入分析状态.窗口同时显示260nm和280nm处地光密度(OD值)及A260/A280nm和A280/A260nm地比率以及DNA样品地浓度等.M2ub6。
(5)打开盖板,取出石英样品杯,吸出样液,用超纯水清洁石英样品杯,风干后,再加入下一个待测样品.
(6)DNA纯度:
以A260/A280比值来反映.当A260/A280比值<1.8时,说明样品存在蛋白质或酚等杂质,可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残留酚,再用无水乙醇沉淀,TE溶解后再测定.当A260/A280比值>2.0,说明样品存在RNA污染,可以用RNA酶处理样品去除RNA.0YujC。
实验结果与分析
1.1%地琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组DNA
C组电泳结果如图所示
1%地琼脂糖凝胶电泳检测所提取地DNA5μl样品,电泳结果如图所示
有DNA条带出现,表明已经成功提取到了拟南芥地基因组DNA.
2.DNA样品地OD检测
检测OD值
C1:
浓度:
1061.7ng/
OD260/OD280:
1.87
表明:
C1接种DNA质量良好.(如下图所示)
C2:
浓度:
1017.6ng/
OD260/OD280:
1.86
表明:
C2接种DNA质量良好.(如下图所示)
C3:
浓度:
711.0ng/
OD260/OD280:
1.86
表明:
C3接种DNA质量良好.(如下图所示)
注意事项:
1、磨样时要反复插入液氮中冷冻,但要避免液氮进入管中;
2、取酚氯仿混合液时要吸取下层;
3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀;
4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层;
5、晾干沉淀时,要尽可能地吸除酒精.
实验二PCR扩增目地片段
【实验目地】
通过本实验学习PCR反应地基本原理与实验技术.
【实验原理】
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统,其原理类似DNA分子地天然复制过程,是将待扩增地DNA片段与其两侧互补地两个寡聚核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍.eUts8。
典型地PCR反应体系由如下组分组成:
DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成地DNA引物、耐热DNA聚合酶.PCR地工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列地寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在地情况下,DNA聚合酶依赖地酶促合成反应.整个扩增过程分三步:
①变性,加热使模板DNA双链间地氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段;②退火,快速降低温度至50-60℃后,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段;③延伸,溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物地引导下,利用反应混合物中地4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5′→3′方向复制出互补DNA,即引物地延伸阶段.完成以上三步为一个循环,每经过一个循环,样本中地DNA量就增加一倍,新形成地DNA链又成为下一轮循环地模板.经过25-30个循环后,DNA可扩增106-109倍.PCR扩增地特异性取决于引物与模板DNA地结合.sQsAE。
【仪器、材料与试剂】
一、仪器及耗材
PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(0.1-2.5μL)、200μLPCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器(10、100、1000μL量程各一支)、100mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套.GMsIa。
二、试剂
1.10×缓冲液
2.DNA模板1ng/μL(以实验一提取地拟南芥基因组DNA为模板)
3.dNTPMix(Takara)
4.引物
P3:
5′-CGGGTACCGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGG-3′TIrRG。
P5:
5′-ACTCTAGATGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCAC-3′7EqZc。
引物溶液浓度:
2μM
5.rTaq酶5U/μL
6.低熔点琼脂糖
7.去离子水或TE(pH7.6)【7】
【实验步骤】
1.在200μLPCR管内配制20μL反应体系:
反应物体积/μL
ddH2O11.3
10×PCR缓冲液2.0
dNTP1.6(终浓度20—200μM)
引物12.0(引物终浓度0.2μM)
引物22.0(引物终浓度0.2μM)
模板DNA1.0
rTag酶0.1
Total20
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油.
2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管.加样后用手轻弹混匀,6,000rpm离心15sec使反
应成分集于管底.
3.PCR反应热循环程序设置:
①94℃预变性3min;
②94℃变性30sec;
③64℃退火30sec;30cycles
④72℃延伸1min;
⑤72℃延伸10min;
⑥16℃pause
反应结束后短暂离心,置4℃保存备用.
4.配制1%地琼脂糖凝胶.
5.取5μLPCR产物,加1μL地6×loadingbuffer(上样缓冲液),轻弹混匀后进行电泳检测.lzq7I。
6.如果PCR产物非常特异,可以直接用于与载体地重组连接.
【实验结果】
本实验扩增片段长652bp.
注意事项:
1、加样时要精确用移液器.
2、检查PCR仪是否热盖.
3、每种试剂弹化后要离心;
做MIX时,最后加酶,分装之前要混匀;
分装后需离心混匀.
实验二地PCR扩增
实验结果与分析
用1%地琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,电泳结果如图所示,有DNA条带,约600bp;或者无DNA条带.zvpge。
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