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细胞培养完整手册
细胞培养完整手册
常用设备
准备室的设备:
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品柜(放置消毒过的物品)、包装台。
配液室的设备:
扭力天平和电子天平(称量药品)、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。
培养室的设备:
液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80℃)、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。
必须放在无菌间的设备:
离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱(放置serum和培养用液)。
无菌操作基本技术
无菌室的灭菌:
1.定期打扫无菌室:
每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱(培养箱)灭菌:
先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射。
3.实验前灭菌:
打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟。
4.实验后灭菌:
用75%酒精(3‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
5.定期检测下列项目:
钢瓶之CO2压力;CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换);无菌操作台内之airflow压力,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。
6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:
750),定期更换水槽的水。
实验人员的无菌准备:
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3.用75%酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示:
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌
4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消:
一、新的玻璃器皿的洗消:
1.自来水刷洗,除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸:
烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干:
12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗:
用清洁液(重铬酸钾120g:
浓硫酸200ml:
蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装:
洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。
6.高压消毒:
包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消:
1.刷洗、烘干:
使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。
2.泡酸、清洗:
烘干后泡入清洁液(酸液),12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装:
洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒:
包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。
(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)
5.烘干备用:
因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消:
金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压(30分钟)消毒,再烘干备用。
橡胶和塑料:
橡胶和制品通常处理方法是:
先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:
1.针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。
注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2.胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟),自来水洗净,烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。
最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。
3.胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(切记时间不能过长),自来水洗净,烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。
最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。
4.胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶,培养板,冻存管.
6.其他消毒方法:
有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。
塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。
也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。
用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。
其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。
密写墨水的配制:
氯化钻(CoC12·6H2o)2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。
注意事项:
1.严格执行高压锅的操作规程:
高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。
检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上:
注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:
A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。
B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。
C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。
细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂:
干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤:
一、水的制备:
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。
二、PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:
Hanks,D-Hanks液的配制):
1.溶解定容:
将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒:
将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒:
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:
D-Hanks液。
终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶:
按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。
搅拌混匀,置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒:
配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
四、抗生素溶液的配制
1.所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。
青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。
链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
1单位=1微克?
4.细胞库之细胞培养基不加抗生素
5.培养自ATC引进之细胞株,培养基中不加抗生素。
6.培养自其它实验室引进之细胞株,制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素,待tokenfreeze通过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。
7.寄送活细胞时,须将培养液充满整个flask时,则须添加抗生素。
(penicillin100units/ml+
streptomycin100ug/ml)
8.若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加gentamicin,因gentamicin会抑制mycoplasma生长。
9.去除细菌污染之抗生素混合配方:
penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,
neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml
注意混合使用后药物毒性会增强。
10.抗生素使用种类与浓度:
工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌
penicillin 100units/ml -20℃ G(+)bacteria
streptomycin 100ug/ml -20℃ G(+)andG(-)bacteria
chlotetracycline 50ug/ml -20℃ G(+)andG(-)bacteria
gentamicin 50ug/ml -20℃ G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma
amphotericinB 2.5ug/ml -20℃ yeastandmolds
nystatin 50ug/ml -20℃ yeastandmolds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeastandmolds
五、RPMI1640的制备与消毒:
1.溶解、调PH值、定容:
先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。
然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。
最后定容至1000ml,摇匀。
2.安装蔡式滤器:
安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。
然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤:
配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。
通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装:
将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。
六、血清:
1.血清的灭火:
细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。
血清必须贮存于–20~-70℃,若存放于4℃,请勿超过一个月。
如果一次无法用完一瓶,可将40~45ml分装于无菌50ml离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10%,必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2.一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。
若发现血清有许多悬浮物,则可将血清入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。
3.瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):
-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,一般50ml无菌离心管可分装40~45ml。
在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡,使温度与成分均一,减少沈淀的发生。
勿直接由-20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
4.heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。
加热过程中须规则摇晃均匀。
此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。
除非必须,一般建议作此热处理,因为会造成沈淀物之显著增多,且会影响血清之品质。
补体参与之反应有:
cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphag℃ytosis,chemotaxisandactivationoflymph℃yticandmacrophagecelltype。
5.勿将血清置于37℃太久,若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。
6.血清之沉淀物
6.1凝絮物:
发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。
若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000rpm,5min去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。
不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜。
6.2显微镜下观察之“小黑点”:
通常经过热处理之血清,沉淀物的形成会显著的增多。
有些沉淀物在显微镜下观察像是小黑点,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37℃中欲培养此微生物“,但在37℃环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。
一般而言,此黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品应立即停用,更换另一批号的血清。
七、HEPES溶液:
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N'-a-hydroxythylpiperazine-N'-ethanesulfanicacid)。
对细胞无毒性作用。
它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。
使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下:
准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。
过滤除菌,分装后4℃保存。
注意:
因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。
如:
称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。
八、谷氨酰胺:
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。
在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。
由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。
加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。
可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。
配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
九、肝素溶液的配制:
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。
因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为℃。
使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。
十、Ⅰ型胶原酶:
0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。
注意:
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
分装入10ml小瓶-20℃保存。
十一、明胶溶液:
因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。
所以制备过程中必须要注意无菌操作。
首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。
其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。
注意事项:
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。
细胞培养的一般过程
一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试,具体内容可参阅有关文献。
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
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理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基。
如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
每传代一次称为“一代”。
二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。
转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。
培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
四、冻存及复苏
为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度?
-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。
在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。
复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解。
然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
细胞原代培养
一、原理
将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。
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二、仪器、材料及试剂
仪器:
培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)
材料:
胎鼠或新生鼠
试剂:
1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank’s液,碘酒
三、操作步骤
(一)胰酶消化法
1、器材:
将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
附:
Hank’s液配方:
5mKH2PO40.06g,Nacl8.0g,NaHCO30.35g,KCl0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4·H2O0.06g,加H2O至1000mlG1
注:
Hank’s液可以高压灭菌。
4℃下保存。
3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6、静置5—10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm,离心10分钟,弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
9、加入培养液l—2ml(视细胞量),血球计数板计数。
10、将细胞调整到
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