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分子复习提纲
1.原核基因组与真核基因组(prokaryoticgenomesandeukaryoticgenomes)
大小(size)
基因结构(genestructure:
continuouscodingsequences,splitgenes)
非编码序列(non-codingsequences:
repeatedsequences,introns)
细胞器基因组(organellegenomes:
mitochondrialgenomes,chloroplastgenomes)
(部分基础概念见手写版笔记:
基因组,染色体组,分类及各类英文名称,C值佯谬,大小单位)
Size:
原核生物的genomesize一般都比较小,且变化范围也不大(最大/最小约为20)。
由于原核生物基因组中的非基因DNA(non-genicDNA)的含量较少,因此它们的基因组大小与其所。
、含的基因数目是相对应的;
真核生物的genomesize一般要比原核生物的大很多,且变化范围也很大
Structure:
类核基因组:
环状,较小;通常由单拷贝或低拷贝(low-copy)的DNA序列组成;基因排列紧密,较少非编码序列——“streamlined”
核基因组:
多线状;大小一般要比类核基因组大好几个数量级,且变化范围很大;有大量的非编码序列(重复序列、内含子等)
Non-codingsequences:
非编码序列(non-codingsequences)
⑴非编码的重复序列(核基因组)
局部分布的重复序列(localizedrepeatedsequences):
串联式(tandem)的高度重复序列(highlyrepeatedsequences):
重复单位的长度从几bp到几百bp,可重复几十万次或更多,常见于着丝粒、端粒和异染色质区域;
散布的重复序列(dispersedrepeatedsequences):
短的散布式重复序列(shortinterspersedelements,SINEs):
500bp以下,可重复105次或更多,很多SINEs都是反转录转座子(retroposon)
长的散布式重复序列(longinterspersedelements,LINEs):
5kb以上,可重复104次或更多,很多LINEs也是与反转录转座子相关的序列
⑵内含子(intron):
I类(groupIintron);II类(groupIIintron);III类(groupIIIintron);核mRNA内含子(nuclearmRNAintron),即剪接体内含子(spliceosomalintron);核tRNA内含子(nucleartRNAintron);古细菌内含子(archaebacterialintron)
organellegenomes:
线粒体基因组:
在不同类型的生物(多细胞动物、高等植物、原生动物、藻类、真菌)中变化很大。
多细胞动物:
细小、致密,没有或很少非编码序列;高等植物:
复杂、不均一,比动物的大得多;原生动物、藻类、真菌:
或偏向于动物型,或偏向于植物型,但又有其各自的独特之处
叶绿体基因组:
比较均一,85~292kb(大部分都在120~160kb之内)
2.转录(transcription)
(1)RNA聚合酶(RNApolymerase)
原核生物:
1种,全酶(holoenzyme)由核心酶与亚基组成,亚基的作用
真核生物:
3种,由多个亚基组成
PolymeraseI:
largerRNAprecursor
PolymeraseII:
mRNAprecursors,snRNAs
PolymeraseIII:
tRNAprecursors,5SrRNAprecursor,U6,etc.
1.转录机器(装置)(transcriptionapparatus)
(1)RNA聚合酶(RNApolymerase)
细菌RNA聚合酶
(40kD)
(155kD),‘(160kD)
(32~90kD)
E.coliRNA聚合酶
核心酶(coreenzyme):
,‘,2
全酶(holoenzyme):
,‘,2,
:
specificityfactor
真核生物的RNA聚合酶
⑴RNA聚合酶I(polymeraseI):
位于核仁
RNA聚合酶II(polymeraseII):
位于核质
RNA聚合酶III(polymeraseIII):
位于核质
三种RNA聚合酶对转录抑制剂的反应
-鹅膏蕈碱(-amanitin):
抑制polymeraseII(低浓度);抑制polymeraseII和polymeraseIII(高浓度)
放线菌素D(actinomycinD):
抑制polymeraseI
(2)真核RNA聚合酶的亚基组成
PolymeraseI、II、III都由多个亚基组成
均有两个较大的亚基(>100kD)
另有多个较小的亚基(大部分<50kD)
三种聚合酶都有一些共有亚基(commonsubunit)
以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PolII为参照:
Rpb5、Rpb6、Rpb8、Rpb10、Rpb12
RNA聚合酶II的结构
有12个亚基(Saccharomycescerevisiae中)
Rpb1、Rpb2、Rpb3、Rpb4、Rpb5、Rpb6、Rpb7、Rpb8、Rpb9、Rpb10、Rpb11、Rpb12(Rpb:
RNApolymeraseB(II))
①核心亚基(coresubunits)
Rpb1,Rpb2,Rpb3,对聚合酶的活性必不可少
分别与原核RNA聚合酶的’,和亚基同源,且功能也基本相同(Rpb3在聚合酶中也是有2个拷贝)
②共有亚基(commonsubunits)
与Rpb5,Rpb6,Rpb8,Rpb10,Rpb12相应的亚基,在3种RNA聚合酶中都存在
在3种聚合酶中都存在,说明它们是起着十分重要的作用,但具体的功能不很清楚
③非必需亚基(nonessentialsubunits)
Rpb4,Rpb9,其基因的突变体在正常温度下仍有活力,但在较高或较低温度下则失去活力
Rpb4和Rpb7(必需的亚基)与启动子的识别有关(有点像因子)
Rpb9的功能不甚清楚
④Rpb7和Rpb11:
另类亚基(不属于上述3类)
RNA聚合酶的活性所需(Rpb7与启动子的识别有关)
核心亚基Rpb1的特殊之处:
不均一性(heterogeneity)
在细胞内,有210kD和240kD两种形式(IIa和IIo);在体外,还有180kD这种形式(IIb)
与对-鹅膏蕈碱的敏感性有关
RNA聚合酶II的结构
在体内,含IIa的聚合酶II为RNApolymeraseIIA;含IIo的聚合酶II为RNApolymeraseIIO
RNApolymeraseIIA是与启动子结合时的形式
RNApolymeraseIIO是延伸时的形式
(2)顺式作用元件与反式作用因子(cis-actingelementsandtrans-actingfactors)
启动子(promoters)、增强子(enhancers)为顺式作用元件
原核启动子:
-10box(Pribnowbox),-35box
真核启动子:
I类,II类,III类
增强子:
较多在真核生物中存在
转录因子(transcriptionfactors)为反式作用因子,真核基因的转录需反式作用因子
通用转录因子:
I类,II类,III类
基因特异转录因子(激活子)
(2)启动子(promoter)
聚合酶的结合位点(bindingsite),一般位于转录起始位点上游
RNA聚合酶与启动子的结合(RNApolymerase/promoterbinding)
Closedpromotercomplex变成Openpromotercomplex,转录才能开始
Promoterstructure
共有序列(consensussequence)
-10box(Pribnowbox):
解链
-35box:
识别
-10box与-35box的最佳距离为171bp
下调突变(downmutation)上调突变(upmutation)
UPelement(上游元件)
在核心启动子上游的一段富含AT的序列
与RNA聚合酶的α亚基相互作用
一些强启动子的额外元件
E.coli编码rRNA的rrngene中的UPelement可提高数十倍表达效率
真核生物的通用转录因子:
真核RNA聚合酶仅靠自身不能与启动子结合,它们需要转录因子(主要是蛋白质)的协助
转录因子有两类
通用转录因子(generaltranscriptionfactors):
通用转录因子能使聚合酶结合到启动子上,形成预起始复合体(preinitiationcomplex),包括形成开放的启动子复合体(openpromotercomplex),但只能导致基础水平的转录
基因特异转录因子(gene-specifictranscriptionfactors)
(1)II类因子(classIIfactors)
PolymeraseII转录所需的通用转录因子
㈠II类预起始复合体
包含有RNA聚合酶II及6种通用转录因子:
TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH
TFIID在TFIIA的协助下,首先结合到TATAbox,形成DA复合体,然后TFIIB再结合上去
TFIIF协助polymeraseII结合到DNA链上(-34~+17区域)
TFIIE、TFIIH结合到复合体中,形成DABPolFEH预起始复合体
①TFIID的结构及功能
TFIID本身是一个复合物,
含1个TATAbox结合蛋白(TATAbox-bindingprotein,TBP)【TATAbox结合蛋白(TBP)
序列非常保守的一种蛋白质(约38kD),包含180个氨基酸的羧基末端,该末端是TATAbox结合域(bindingdomain)TBP是马鞍形的,结合到DNA双螺旋的小沟上,使TATAbox弯曲80°及小沟打开,能作用于所有3类启动子(classII,I,III)】
和8~10个TBP相联因子(TBP-associatedfactors,TAFsorTAFIIs)【TBP相联因子(TAFIIs):
至少有8种,序列上也相当保守。
主要功能:
促进转录;与启动子的元件相互作用(起始子、下游元件);与基因特异转录因子相互作用(如Sp1)
TAFIIs中的TAFII250还有酶的功能,如作为组蛋白乙酰转移酶
TFIIA与TFIIB的结构及功能
TFIIA:
可以看成是一种TAFII(与TBP结合,能稳定TFIID与启动子之间的结合)
在体外体系中,TFIIA并非必不可少
TFIIB:
单亚基的因子(35kD),能把TFIID与TFIIF/PolII相连在一起,即是聚合酶II结合到预起始复合物所必需的,能与一些基因特异转录因子相互作用,促进转录】
②TFIIF的结构及功能
由2条多肽构成:
RAP30与RAP70(RAPstandsforRNApolymeraseII-associatedprotein);RAP30与E.coli的因子有一定的同源性,能使TFIIF结合到PolII
TFIIF与PolII结合后,能减少聚合酶与DNA之间非特异的相互作用,引导聚合酶到已结合有TFIID、TFIIA和TFIIB的启动子上
③TFIIE和TFIIH的结构及功能
TFIIE:
有2个亚基(56kD,34kD),每个亚基在TFIIE中都有2个拷贝(总分子量约为200kD),能结合到DABPolF的复合体上,对转录有促进作用
TFIIH:
最后一个结合到预起始复合体的通用转录因子,有9个亚基,具多种功能
具有激酶活性:
使PolII最大亚基的羧基末端域(CTD)磷酸化,PolIIA变为PolIIO,导致转录起始过渡到转录延伸
具有DNA解螺旋酶和ATP酶活性,为聚合酶离开启动子向前转录(promoterclearance)所需
㈡延伸因子(elongationfactors)
TFIIS
能促进转录延伸,阻止在转录过程中聚合酶在特定的DNA位点(暂停位点)较长时间的暂停;能促进转录物校正,通过激发聚合酶内在的RNase活性来切除错误的核苷酸
TFIIF;也有阻止聚合酶在随机的DNA位点短暂停止的功能
RNA聚合酶II的全酶(thepolymeraseIIholoenzyme)
RNA聚合酶II的所有亚基+部分通用转录因子+其他一些蛋白质因子
(2)I类因子(classIfactors)
PolymeraseI转录所需的通用转录因子
I类预起始复合物
RNA聚合酶I
2种通用转录因子(I类因子):
SL1;UBF(上游结合因子,upstream-bindingfactor)
SL1:
由TBP(TATAbox结合蛋白)与3种TAFs(TAFIs,TBP相联因子)组成的复合物。
SL1自身不能直接与启动子结合,但它能加强UBF与启动子的结合,促进预起始复合体形成;SL1还是rRNA基因转录的物种特异性的决定因素之一
UBF:
由2条多肽构成(97kD和94kD),而97kD的多肽即具UBF的活性
能与I类启动子的核心元件及UCE(上游控制元件)的位点结合,再与SL1一起,促进转录
(3)III类因子(classIIIfactors)
PolymeraseIII转录所需的通用转录因子
III类因子有TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC
TFIIIB和TFIIIC是所有在基因内部有III类启动子的基因的转录所需的
5SrRNA基因的转录还需要TFIIIA
TFIIIA
一类含“锌指”(zincfinger)的DNA结合蛋白的成员【锌指是4个氨基酸与1个Zn离子结合,再加上其他的氨基酸,构成手指状】
在TFIIIA中,4个氨基酸是cys-cys-----his-his,连续有9个锌指
锌指能使蛋白质与DNA紧密结合
TFIIIB和TFIIIC
两者共同起作用
TFIIIC结合到基因内部的启动子中(如果是5SrRNA基因,则先有TFIIIA结合到启动子区),再帮助TFIIIB结合到启动子上游区(转录起始位点上游),而TFIIIB则帮助PolIII结合在起始位点周围
转录开始后,TFIIIC(或TFIIIA和C)被除去,而TFIIIB留在原位,可促进另一轮的转录
具外部启动子的基因的转录因子
TFIIIB含有TBP(TATAbox结合蛋白)及一些TAFIIIs,可结合到启动子的TATAbox,从而促进转录
可能还需要其他一些通用转录因子
(4)TBP在3类转录因子中的作用
作为装配因子(assemblyfactor)与TATAbox结合
组织预起始复合体(特别是对于无TATA启动子),促进转录
(3)多顺反子转录与单顺反子转录
多顺反子转录是原核生物的转录方式:
操纵子(operons)
经典模型:
乳糖操纵子(thelacoperon)
弱化作用的调控:
色氨酸操纵子(thetrpoperon)
单顺反子转录是真核生物的主要转录方式
1、操纵子
(1)乳糖操纵子(thelacoperon)
lacZ:
-半乳糖苷酶(-galactosidase)基因
lacY:
半乳糖苷透过酶(galactosidepermease)基因
lacA:
半乳糖苷乙酰基转移酶(galactosidetransacetylase)基因
lacI:
调节基因(regulatorygene)
①Operator:
操纵区
Repressor:
阻遏子(阻遏物)
Inducer:
诱导物(异构乳糖,allolactose)
野生型(可被诱导型)等位基因是显性的,说明野生型等位基因能产生某种物质,使与乳糖代谢有关的基因关闭,在被诱导后才表达
推测:
这种物质可称为阻遏物(repressor):
组成型突变体是产生阻遏物的基因有缺陷
应该有与repressor结合的DNA序列(operator):
若operator有突变,不能与repressor结合,是一种显性的组成型突变体
结论:
通过阻遏基因(阻遏物)与操纵区,lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起被调控的,它们组成了一个操纵子(thelacoperon)
阻遏的机制:
两种假说
聚合酶与阻遏物可一起结合在lacoperon的启动子区,阻遏物的作用只是阻止转录从起始状态进入延伸状态
阻遏物的作用是不让RNA聚合酶进入lacoperon的启动子(得到最新实验数据的支持)
操纵区(Operator):
有三个操纵区
一个主要的操纵区(靠近转录起始位点)
两个辅助的操纵区(一个在上游,一个在下游)
三个操纵区在一起可以发挥最佳的阻遏作用:
主要操纵区和一个辅助操纵区在一起可以起很好的作用,仅有主要的操纵区只能产生较弱的阻遏作用
阻遏物(Repressor)
两个二聚体构成四聚体
每个二聚体都含有两个与DNA大沟相互作用的DNA结合域
每个二聚体都能结合一个操纵区,使整个阻遏物能同时结合两个操纵区
②乳糖操纵子的正调控
阻遏物的调控是负调控,乳糖操纵子的调控还需正调控因子
代谢物阻遏效应(cataboliterepression)
环腺苷酸(cyclic-AMP,cAMP)在细胞中的浓度与葡萄糖的含量成反比,它与代谢物激活蛋白(cataboliteactivatorprotein,CAP,又称环腺苷酸受体蛋白:
cAMPreceptorprotein,CRP)共同起正调控作用。
因此,起正调控作用的是CAP-cAMP
乳糖操纵子的启动子是一种弱启动子,其-35box与原核启动子的共有序列差别很大,因此才需要CAP-cAMP进行正调控(如果是强启动子(与共有序列十分相近),则不需要正调控,但这种情况会使得即使葡萄糖存在,乳糖操纵子也一样运作)
(5)CAP的作用机制
CAP-cAMP的结合位点在启动子的上游(与启动子紧密相邻),该位点称为激活物位点(activatorsite)(TGTGA共有序列)
CAP-cAMP结合到激活物位点后,就会促进RNA聚合酶与DNA形成openpromotercomplex(CAP-cAMP能加快closedpromotercomplex的形成,从而提供了更多形成openpromotercomplex的机会),结果是促进转录
CAP的作用机制(手写版笔记)
CAP-cAMP通过增加KB而促进第一步
CAP-cAMP对k2的影响极小,没有促进第二步
CAP-cAMP通过与RNA聚合酶α-CTD的蛋白-蛋白相互作用进行募集(recruitment)
CAP-cAMP结合到靶DNA时,将其弯曲成大约100°
乳糖操纵子调控小结
葡萄糖乳糖负调控正调控转录
++诱导物低cAMP本底水平
+-阻遏物低cAMP无
--阻遏物CAP-cAMP无
-+诱导物CAP-cAMP激活水平
⑵阿拉伯糖操纵子(thearaoperon)
像乳糖操纵子那样,也是一种有代谢物阻遏效应的操纵子
thearaoperon又称thearaCBADoperon,即有控制基因C和结构基因B、A、D(编码阿拉伯糖代谢所需的酶)
独特之处:
两个ara操纵区:
araO1和araO2,前者调控控制基因araC的转录,后者控制启动子PBAD(在PBAD上游265与294bp之间)
CAP(cataboliteactivatorprotein)结合位点在ara启动子(PBAD)的上游约200bp处
araC的自我调节(autoregulation)
araO1起作用:
当AraC(araC的产物)含量升高,便与araO1结合,阻止进一步转录araC,以免产生过多的AraC
⑶色氨酸操纵子(thetrpoperon)
合成代谢的操纵子,所编码的酶能把色氨酸前体分枝酸(chorismicacid)转化为色氨酸。
色氨酸浓度高,则关闭;色氨酸浓度低,则开启
具弱化子(attenuator),无CAP-cAMP调控
色氨酸操纵子有5个结构基因(EDCBA)及1个调节基因(R)
启动子(trpP)与操纵区(trpO)在结构基因的上游,且操纵区完全在启动子里面
在调控中,色氨酸的作用是帮助阻遏物结合到操纵区,从而使操纵子关闭
弱化作用(attenuation):
在阻遏作用的基础上(色氨酸操纵子的阻遏作用较弱),能再降低转录水平10倍。
前导区与弱化子转录物的第一种较稳定的结构有一终止子(-independentterminator),能使弱化作用发生,转录终止
转录物的第二种较不稳定的结构没有终止子,转录能继续
色氨酸的多寡决定形成哪一种结构(在转录与翻译偶联的情况下)
在细菌中,当色氨酸操纵子的前导区转录后,翻译就开始;核糖体到达色氨酸密码子:
色氨酸缺乏,核糖体不能前进,翻译受阻,前导区与弱化子转录物只能形成第二种结构;结构基因能转录;色氨酸充足,前导肽的翻译能顺利完成,前导区与弱化子转录物能形成第一种较稳定的结构,导致弱化作用发生
调控能达成的必要条件
转录与翻译偶联,且速率大致相等
每个结构基因的转录产物都有其起始密码子,核糖体从各个基因的mRNA的起始信号(密码子)开始翻译,即结构基因的翻译与前导序列的翻译无关
细菌能符合这样的要求,说明其体系中各组分的协调性
2、基因表达调控的重大变化
(1)宿主RNA聚合酶的变化
主要由因子的改变引起
①枯草杆菌(Bacillussubtilis)被其噬菌体SPO1入侵后的情况
SPO1早期基因(earlygenes)的表达:
用宿主本身的RNA聚合酶,仍可有很多宿主基因表达
SPO1中期基因(middlegenes)的表达:
宿主中基本上只有噬菌体的基因在表达
SPO1后期基因(lategenes)的表达
②T7噬菌体编码的RNA聚合酶
T7基因的转录分3个阶段(在宿主E.coli中)
ClassI(共5个基因,其中一个编码一种噬菌体专一的RNA聚合酶)
ClassII
ClassIII
先由宿主的RNA聚合酶,然后由T7自己的RNA聚合酶来达成3个阶段的转录
③芽孢形成过程的转录控制(枯草杆菌)
通过变换RNA聚合酶的因子而达成。
每种因子所识别的启动子都各不相同
从营养(植物性)生长到产生内生孢子(芽孢):
需关闭很多营养生长期的基因,并开启专门用于芽孢形成的基因
营养生长期RNA聚合酶的因子43(A)
芽孢形成时RNA聚合酶的因子至少有29(E)、30(H)、32(C)
④具多启动子的基因
枯草杆菌的spoVG基因
芽孢形
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