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项目需求分析调研报告
“转基因小麦新品种培育”项目需求分析调研报告
转基因生物技术的发展,推动了常规育种技术的全面升级,大幅度提升了选育植物优良品种的能力,催生了新兴产业的发展。
21世纪是生物经济时代,以转基因技术为核心的生物产业已成为美国等发达国家生物经济的主导产业。
近年来,全球转基因农作物的种植面积呈现逐年大幅度增长的趋势。
自1996年转基因作物商业化应用以来,全球累计推广面积已达122.4亿亩,2008年推广面积已达18.9亿亩,约占全球耕地面积的8%,种植转基因作物的国家达到25个。
目前,世界各国已累计批准23种转基因作物商业化应用。
以提高产量、增强抗性、改善营养、增进健康等为主要目标的新一代转基因作物的研究开发速度显著加快。
一、国际研发现状与发展趋势
1、重要功能基因研究
重要基因的挖掘与鉴定成为竞争的焦点。
拥有自主知识产权的重要基因是转基因新品种培育的基础。
目前跨国公司通过手中的专利基因,牢牢地控制着国际种业市场,世界各国越来越认识到基因资源对农业发展的重大意义。
1989年启动国际小麦族遗传作图计划,1998年成立了小麦EST研究国际合作组织,目标是确定和破译小麦基因组所有基因在染色体上的位置和功能,目前已建立了小麦族EST公共数据库。
近年来,欧美等发达国家正在加紧小麦基因组测序工作,全球范围内的生物基因资源的争夺日趋激烈,基因挖掘和克隆正在从纯粹的功能基因向调控基因等延伸。
重要基因的发现与功能研究将迅速走向应用。
近年来,国际上在抗病虫、抗逆、优质及资源高效利用相关基因克隆与功能验证方面取得较快的发展,为开展小麦转基因育种提供了基础。
抗病虫基因克隆:
迄今为止,已从小麦中克隆的部分抗性基因为数不多(见表1),国际上通过图位克隆方法分离出3个小麦抗病基因,包括抗叶锈病基因Lr10(HuangL等2003)、Lr21(FeuilletHA等2003)、和抗白粉病基因Pm3b(YahiaouiN等2004),其功能已经获得验证。
此外,还分离了小麦抗线虫基因Cre3(Lagudah等2001),抗条锈病基因Yr10等候选基因。
另外,从小麦中克隆的抗病相关基因还有:
几丁质酶基因(Lorz等1998;Li等2001;Kong等2005),β-1,3-葡聚糖酶基因(Li等.2001),PR4(BertiniL等2006),germlike基因TaGLP2、WIR3、TaGLP4(Wei等1998;Schweizer等1999),Dehydroascorbatereductase(DHAR,Chen等2003)和glotahioneS-transferase(GST,Cummins等2002)等。
表1.从小麦中克隆的抗病、抗虫基因
基因符号
主要功能
文献
Lrk10
叶锈病抗性
Feuilletetal(1997)
Lr10
叶锈病抗性
Feuilletetal(2003)
Lr1
叶锈病抗性
Lingetal
Lr21
叶锈病抗性
Huangetal(2003)
Wch2
锈病抗性
李和平等(2003)
TaLRK
锈病抗性
Niuetal(2006)
)
S2A2和LRR1
叶锈病抗性
WangHYetal(2006)
TaGLP4
白粉病抗性
WeiY-Detal(1998)
SchweizerPetal
(1999)
Pm3b
白粉病抗性
YahiaouiNetal(2004)
几丁质酶基因
抗病性
Lorzetal.(1998);Lietal.(2001);Kongetal.(2005)
葡聚糖酶基因
抗病性
Lietal.(2001)
GST
抗病性
Cumminsetal.(2002)
DHAR
抗逆性
Chenetal.(2003)
PR-9
抗病性
Bagaetal(1995)
OxO
抗病性
Liangetal(2001)
RPL3
赤霉病抗性
Lucyshynetal(2007)
SM194,SM383,SM289,SM638
赤霉病抗性
Lietal(2001)
Chi1
赤霉病抗性
KongLRetal(2005)
PR4
赤霉病抗性
BertiniLetal(2003)
Cre3
线虫抗性
Lagudahetal(1997)
抗逆基因克隆:
在小麦中已分离出一些抗逆相关基因,如在抗逆性中直接发挥功能的编码LEA蛋白的基因PMA80、PMA1959、PMA1949以及脱水素基因Wdhn13(LEAD-11家族);受低温胁迫诱导表达的Wcor15,Na+/H+逆向转运蛋白TNHX1等。
目前,对这类基因的具体功能研究的比较透彻,获得了一些耐旱、耐盐的转基因植物。
但是,转基因小麦的抗逆性提高幅度尚不能达到育种应用的水平。
近年来,对编码参与调控下游基因表达以及信号传导的蛋白激酶、依赖钙的蛋白激酶(CDPK)、受体蛋白激酶(RPK)和转录因子(如bZIP、MYC、MYB及AP2/EREBP转录因子等)等基因的研究倍受关注,如克隆了受盐和ABA诱导的蛋白激酶PKABA1,受干旱、高盐、低温和ABA诱导的AP2/EREBP转录因子TaDREB基因等。
近年来,转录因子基因功能研究取得突破,成为抗逆转基因研究的热点。
表2小麦中已被克隆的与耐盐、耐旱有关的基因
基因符号
主要描述
参考文献
TmHKT7
AGeneforSaltToleranceinDurumWheat
Huangetal.,2006
TaAIDF
CharacterizationoftheTaAIDFageneencodingaCRT/DRE-bindingfactorresponsivetodrought,high-salt,andcoldstressinwhea
Zhao-ShiXuetal.,2008
WGA
theWGAgenewasinducedbydrought.
Bhaglaletal.,1999
PMA80andPMA1959
TwowheatLEAgenesenhancedehydrationtoleranceoftransgenicrice.
Chengetal.,2002
PKABA1
PKABA1isup-regulatedbydehydration,coldtemperature,andosmoticStress.
Holappaetal.,1995
LCT1
LCT1GeneratesHypersensitivitytoSodiuminaSalt-SensitiveYeastStrain.
Amtmannetal.,2001
TaHKT1
TaHKT1contributestothedifferenceinionichomeostasisandsalttolerance.
SchachtmanandSchroeder;1994
TNHX1
aNa+/H+antiporterup-regulatedbysalt-stress
Brinietal.,2005
TVP1
ThefirstvacuolarH+-PPasepumpgenefromwheat
Brinietal.,2005
MnSOD
MnSODgenewasdroughtinducibleanddecreasedafterrehydration.
Wuetal.,1999
Cu/ZnSOD
Cu/ZnSODmRNAwasnotdroughtinduciblebutincreasedafterrehydration.
Wuetal.,1999
优质基因克隆:
克隆了影响籽粒蛋白品质的高低分子量麦谷蛋白亚基基因,并明确了可以赋予小麦籽粒优异蛋白品质的高分子量麦谷蛋白亚基基因(如1Dx5,1Ax1亚基基因)以及低分子量麦谷蛋白亚基基因(如KS2,GL1/GL2亚基基因)(Altpeter,etal.,1996;BlechlandAnderson,1996;Baroetal.,1997;Maruyama-Funatsukietal.,2004,2005);克隆了影响籽粒硬度和磨粉品质的Pina和Pinb基因,并明确了可以赋予小麦籽粒优异磨粉品质的等位变异(如Pinb-D1b)(Chenetal.,2006);克隆了参与籽粒淀粉合成的多个基因,如ADPG焦磷酸化酶、颗粒结合型淀粉合成酶、可溶型淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉脱分枝酶(Lalondeetal.,1997;Lietal.,1999,2000;Genscheletal.,2002;McCueetal.,2002;Kuboetal.,2005;Reginaetal.,2005;Shimbataetal.,2005)。
小麦氮磷养分利用相关基因克隆:
克隆了参与氮代谢的一些基因,如硝酸还原酶基因、亚硝酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、以及谷氨酸合酶基因(Boissonetal.,2005);克隆了参与小麦磷吸收的高亲和力转运蛋白的基因(Daviesetal.,2002;Glassopetal.,2005),但是,相关基因的育种利用价值尚有待进一步研究。
小麦光能利用相关基因克隆:
克隆了许多参与光合作用酶类的编码基因(见表3),但是,这些基因在育种上的利用价值尚不十分清楚。
表3小麦中已被克隆的光合相关的基因及其产物
基因产物名称
主要功能
文献
PsbP
光合放氧
JamesandRobinson,1991
PsbI
光系统Ⅱ反应中心复合体亚基
Howeetal.,1988
ELIP
早期光诱导蛋白
Shimosakaetal.,1999
ThioredoxinH
电子传递氧化还原
Serratoetal.,2001
Ferredoxin
电子传递氧化还原
Bringloeetal.,1995
PEPC
催化磷酸烯醇式丙酮酸形成草酰乙酸
Besnard,2004
Rubisco
二氧化碳同化关键酶
Sasanuma2002
RAB1
活化Rubisco酶
Rampinoetal.,2006
GAPD
催化1,3-二磷酸甘油酸形成3磷酸甘油醛脱氢酶
BustosandIglesias,2002
FBPase
催化1,6-二磷酸果糖形成6磷酸果糖
Lloydetal.,1991
SBPase
催化1,7-二磷酸景天庚酮糖形成7-磷酸景天庚酮糖
Rainesetal.,1992
Sucrosesynthase
合成蔗糖
Maranaetal.,1988
Sucrosephosphatesynthase
催化6-磷酸蔗糖形成蔗糖
Castledenetal.,2004
Invertase
催化蔗糖形成葡萄糖和果糖
Greenshieldsetal.,2004
Sucrosetransporter
蔗糖转运
Aokietal.,2002
2、遗传转化技术研究
国际上转基因技术水平目前处于发展完善阶段,标准化、工厂化和流水线式基因转化已成为提高转基因效率的重要途径,安全、高效、规模化成为转基因技术的主要发展方向。
小麦的遗传转化目前依然受到基因型的限制,转化效率尚有待提高。
通过创新转化受体、新型载体、时空表达调控元件、叶绿体遗传转化、定点整合、多基因转化等新型转化方法以及无选择标记基因的安全转基因技术,提高小麦遗传转化的效率和安全性,已成为小麦转基因技术发展的主要方向。
小麦遗传转化研究起步虽晚,但发展较快。
1992年Vasil等利用基因枪介导法将Bar基因导入了小麦,获得了世界上第一例转基因小麦植株。
1993年Weeks等利用基因枪介导法分别将GUS基因、Bar基因导入了小麦,初步建立了基因枪法转化小麦的技术体系。
此后,小麦的基因转化技术研究进展较快。
目前,小麦转基因方法大体可以分为两大类:
一是不依赖于组织培养的转化,如花粉管通道法、显微注射法等;二是依赖组织培养的转化,包括基因枪法、农杆菌介导法、电击穿孔法、PEG法等。
我们对国内外主要学术期刊发表的小麦转基因文献进行统计,发现应用较为广泛的是基因枪法(68.8%)和农杆菌介导法(15.9%),花粉管通道法等其它方法占15.3%。
小麦基因枪法转化效率主要取决于小麦再生体系的效率[14]。
在转化过程中,加入氯化钙和亚精胺能提高核酸与微弹的结合力,选择合适的转基因表达载体及受体组织,优化基因枪轰击参数(包括轰击距离、氦气压、真空条件等)可有效提高基因枪的转化效率[14]。
同时,小麦供体应避免病虫害侵染及不适宜的温度、湿度等,否则会影响供体组织的生理状况和转化时的细胞全能性。
根据载体本身的特点,Uzé等[15]采用与Bar基因共转化的方法评估了线性、环状、双链、单链DNA对转化效率的影响,发现线性双链和单链DNA的转化效率明显高于环状DNA。
基因枪法具有宿主广泛、可控性强、操作简便等优点。
然而,基因枪法在轰击过程中容易导致骨架载体的插入、DNA断裂和多拷贝整合等。
另外,外源基因是随机整合到宿主染色体上,染色体的位置效应或基因的多拷贝整合,会造成外源基因在表达水平存在一定差异,并且可能导致基因沉默。
第一例农杆菌介导的转基因小麦于1997年获得成功[17];Xia等[18]和Weir等[19]也分别报道了利用农杆菌介导法获得转基因小麦植株,并证明外源基因能够稳定表达和遗传。
在小麦农杆菌转化体系中,受体基因型、农杆菌细胞的浓度、接种及共培养时间、载体类型、筛选方式等都会影响转化效率[20]。
2003年Hu等[21]对基因枪法和农杆菌介导法的小麦转化效果进行了比较,结果发现:
农杆菌介导法的转化效率为4.4%,高于基因枪的3.4%;获得单拷贝转基因植株的几率(>60%)为基因枪法(20%)的三倍多。
此外,农杆菌介导法还具有操作简单、成本低、整合位点较稳定,并能转移一些相对较大的DNA片段等优点。
农杆菌介导法近年来已广泛用于小麦遗传转化。
3、新品种培育
迄今为止,转基因小麦品种尚没有进入商业化生产,但是,目前已经具有一批较好的材料储备,并进行了多年的田间试验,抗除草剂转基因小麦已经具备了产业化条件。
转基因小麦主要涉及抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂、品质改良、提高产量等,应用较多的为抗病(39.7%)和品质改良(25.6%)方面(图1)。
图1小麦转基因研究现状
(1)抗病转基因小麦
小麦在整个生长期内,常受到锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病、黄花叶病毒病等多种病害的危害,仅真菌病害每年可造成减产5~10℅[23]。
利用转基因技术培育的抗病转基因棉花、玉米等作物已广泛应用于生产。
尽管转基因抗病小麦尚未进入商品化生产,但是,小麦抗病转基因研究成为小麦分子改良的热点,约占39.7%(图1)。
目前,利用抗病以及防御反应相关的基因已经获得一些具有潜在利用价值的转基因小麦材料(表4)。
应用于转基因小麦的抗病基因包括:
(1)抗病及病程相关蛋白类基因:
如几丁质酶基因和β-1,3葡聚糖酶基因[42-44,47-50]、SGT1[34]、RAR1[36]、类甜蛋白基因[23,45-46]等。
例如,大麦几丁质酶II基因可显著提高小麦对白粉病和赤霉病的抗性[48-49]。
Oldach等[44]将大麦几丁质酶Ⅱ基因和巨曲霉菌抗菌蛋白基因Ag-AFP共转入小麦,转基因株系明显降低了白粉病菌和叶锈菌孢子的形成。
(2)抗菌肽及抗菌蛋白类基因:
如核糖体失活蛋白基因[39]、KP4[54]等。
Clausen等[54]将病毒基因KP4转入小麦,获得抗黑粉菌属真菌的转基因小麦材料。
(3)抗病毒类基因:
如病毒复制酶和外壳蛋白基因[24-26,29-32]、自裂殖酵母来源的Pac1基因[28]、大肠杆菌来源的突变核糖核酸酶基因III[33]等。
(4)真菌酶及毒素抑制基因:
如多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因[53]等。
真菌侵染植物时,往往会释放一种多聚半乳糖醛酸酶,破坏植物细胞壁,PGIP能特异性结合并抑制真菌多聚半乳糖醛酸酶活性,增强植物的抗病性。
Janni等[53]对三个转基因小麦株系的PGIP表达水平、亚细胞定位及对半乳糖醛酸酶的抑制活性进行了分析,发现转基因株系中该蛋白分泌到质外体,并保有对半乳糖醛酸酶的识别特异性。
接种小麦根腐病菌72小时后,与对照相比,转基因小麦株系的症状减轻46%~50%。
目前,小麦抗病转基因研究多为单个抗病基因的转化,通过多种抗病基因的聚合,培育多抗小麦品种将成为小麦抗病分子育种的发展趋势。
小麦赤霉病、纹枯病、根腐病等重要病害在小麦品种中缺少抗源,挖掘抗病基因,利用转基因技术创制抗病小麦材料,将成为今后我国抗病转基因小麦的研究重点。
表4抗病转基因小麦研究现状
基因名称
Geneintroduced
基因来源
Speciesofintroducedgene
功能
Trait
转化方法
Transformationmethod
文献
Referen-ce
病毒复制酶基因
小麦条纹花叶病毒
抗病毒病
基因枪
[25]
Pac1基因
自裂殖酵母
抗病毒病
农杆菌介导法
[28]
病毒外壳蛋白基因
小麦土传花叶病毒
抗病毒病
基因枪
[29]
小麦黄花叶病毒
抗病毒病
基因枪
[30-31]
小麦条纹花叶病毒
抗病毒病
基因枪
[32]
突变的核糖核酸酶基因III
大肠杆菌
抗病毒病
基因枪
[33]
SGT1基因
中间偃麦草
抗小麦黄矮病、白粉病
基因枪
[34]
葡萄糖氧化酶
黑曲霉菌
抗小麦白粉病
基因枪
[35]
RAR1基因
中间偃麦草
抗小麦白粉病
基因枪
[36]
芪合酶基因
葡萄
抗小麦白粉病
基因枪
[37-38]
核糖体失活蛋白基因
大麦种子
抗小麦白粉病
基因枪
[39]
Vp16基因
番茄
抗小麦白粉病
基因枪
[40-41]
β-1,3-葡聚糖酶基因
拟南芥
抗小麦白粉病和根腐病
基因枪
[42]
烟草
抗小麦白粉病
农杆菌介导法
[43]
几丁质酶Ⅱ基因
大麦
抗小麦白粉病和叶锈病
基因枪
[44]
抗菌蛋白Ag-AFP
巨曲霉菌
类甜蛋白基因
小麦
抗小麦白粉病
基因枪
[45]
水稻
抗小麦赤霉病
基因枪
[46]
大麦
抗小麦叶疫病
基因枪
[23]
几丁质酶基因
水稻
抗小麦赤霉病
低能氩离子束介导
[47]
大麦种子
抗小麦白粉病
基因枪
[48]
大麦
抗小麦赤霉病
基因枪
[49]
几丁质酶基因
烟草
抗小麦赤霉病
农杆菌介导法
[50]
β-1,3-葡聚糖酶基因
菜豆
细胞凋亡相关基因BCL
人体细胞
抗小麦赤霉病
农杆菌介导法
[51]
RIP基因
玉米
α-1-曝呤硫素基因
小麦
抗小麦赤霉病
基因枪
[52]
类甜味蛋白tlp-1基因
大麦
β-1,3-葡聚糖酶基因
大麦
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因
栽培大豆
抗小麦根腐病
基因枪
[53]
KP4基因
玉米黑粉菌寄生病毒
抗小麦黑粉病
基因枪
[54]
(2)抗虫转基因小麦
虫害一直是小麦生产的重要影响因素之一。
据不完全统计,在我国为害麦类作物的害虫超过110种,隶属于8目40科以上,主要包括麦蚜、吸浆虫、地下害虫、麦蜘蛛、黏虫、蓟马、麦叶蜂、麦茎蜂等10余类群[55]。
其中以麦蚜为害最为严重,我国常年发生面积达1.5~2.0亿亩,造成小麦减产10%左右,大发生年份超过30%[56]。
近年来,由于全球CO2浓度不断增加、耕作制度变化等使麦蚜的繁殖能力和适应性显著增强[57],其危害面积和危害程度正在不断扩大并日趋严重。
抗虫转基因研究涉及的基因有:
(1)蛋白酶抑制剂基因:
如胰蛋白酶抑制基因BTI-Cme[63],丝氨酸蛋白酶抑制基因PIN2[62]等。
Alpeter等[63]将大麦胰蛋白酶抑制基因BTI-Cme转入小麦,该基因对储存害虫麦蛾有较强的抑制作用,但对小麦叶面害虫作用不大。
(2)外源凝集素基因:
如人工合成及来源于雪花莲的凝集素基因(gna)[58-61],半夏凝集素基因(pta)[64]。
凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白,对蚜虫等同翅目害虫有很强的抗杀作用。
Stöger等[61]将韧皮部特异启动子调控下的gna基因导入小麦,发现转基因株系对小麦长管蚜有抗性,目的基因表达量高于0.04%的植株可以显著降低蚜虫繁殖率,但不影响蚜虫存活率。
Yu等[64]构建了cryIa和pta基因双元表达载体,通过农杆菌介导法转入小麦,对两个转基因小麦株系进行抗虫鉴定,蚜虫的存活率分别为对照的54%和78%,粘虫的存活率分别为对照的65%和73%。
小麦抗虫转基因研究较少,约占7.7%(图1)。
应用于小麦抗蚜的基因主要是gna和pta,抗蚜基因较为单一。
根据Birch等[65]的报道,二星瓢虫取食转gna马铃薯上的蚜虫后,其产卵力、卵的生存力和寿命明显降低,因而,转gna植物对生态环境的影响引起了人们的关注。
挖掘利用新的更加安全有效的抗蚜基因将是小麦抗虫转基因育种的重要课题。
[反]-β-法尼烯(EβF)作为大多数蚜虫报警信息素的主要成份,可以使蚜虫产生骚动、从植株上脱落,并吸引蚜虫天敌。
与常规杀虫剂混用时,可驱使蚜虫主动接触杀虫剂等,即EβF作为蚜虫体内的信息物质,可使蚜虫的虫口密度控制在一定域值之内,有效控制蚜虫危害。
Schnee等[66]和Beale等[67]分别将玉米TPS10和欧洲薄荷EβF合成酶基因转入拟南芥,获得释放EβF挥发物的植株,转基因植株可驱离蚜虫并吸引蚜虫寄生性天敌蚜茧蜂。
利用EβF合成酶基因有可能为创制抗蚜虫转基因小麦提供新的途径。
表5抗虫转基因小麦研究现状
基因名称
Geneintroduced
基因来源
Speciesofintroducedgene
功能
Trait
转化方法
Transformationmethod
文献
Reference
雪花莲凝集素基因
人工合成
抗蚜虫
基因枪
[58-59]
雪花莲
抗蚜虫
基因枪
[60-61]
丝氨酸蛋白酶抑制基因
马铃薯
抗禾谷孢囊线虫
农杆菌介导法
[62]
胰蛋白酶抑制基因BTI-CMe
大麦
抗麦蛾
基因枪
[63]
苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因
苏云金芽孢杆菌
抗蚜虫和粘虫
农杆菌介导法
[64]
半夏凝集素基因
半夏
(3)抗逆转基因小麦
干旱、盐碱和低温等逆境是限制小麦产量的重要非生物胁迫,为了更充分利用现有耕地提高小麦产量,小麦抗逆育种显得尤为重要。
小麦抗逆转基因研究大体涉及以下几类基因:
(1)编码渗透调节物
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