精品质粒DNA的提取与检测.docx
- 文档编号:8080116
- 上传时间:2023-01-28
- 格式:DOCX
- 页数:7
- 大小:409.94KB
精品质粒DNA的提取与检测.docx
《精品质粒DNA的提取与检测.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《精品质粒DNA的提取与检测.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
精品质粒DNA的提取与检测
质粒DNA的提取与检测
1概述
细菌质粒是一些双链、闭环的DNA分子,其大小范围从1kb至2000kb不等。
已经存在形形色色的细菌类群中发现质粒,这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的遗传单位。
然而,它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。
通常,质粒含有编码某些酶的基因,这些酶事实上在一定的环境下可能对细菌宿主有利。
由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等。
质粒DNA的复制由负责复制细菌染色体的多种酶来完成,但是不同的质粒在宿主体内所采用的酶迥然不同,而且在宿主中复制的程度也相差悬殊。
一些质粒的拷贝数可高达700个/细胞,而另一些则只能维持在每套宿主细胞染色体仅对应l个质粒分子的最低水平上。
控制质粒拷贝数的基因处于包括DNA复制起点在内的一个质粒DNA区域内。
通常情况下,一个质粒只含有一个复制起始区(复制子).
目前使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒的复制子。
在正常生长条件下,每个细菌细胞中可维持至少15~20个拷贝(带有该复制子的质粒).一般认为,这种多拷贝的质粒是以松弛方式进行复制的。
pMB1复制子的复制并不需要质粒编码的功能蛋白,而是完全依靠宿主提供的半寿期较长的酶。
因此,即使蛋白质合成并非正在进行,复制依然能够进行。
这样,当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素存在时,带有pMB1复制子的质粒将继续复制,最后每个细胞中可以积聚两三千个拷贝。
单向复制从DNA复制起点开始,由一个RNA引物所引导,该引物的启动子位于复制起点上游大约550bp处。
新生的RNA与DNA模板形成稳定的杂交体,作为RNA酶H的底物,由RNA酶H切割从而产生引导DNA合成的引物。
而RNAⅡ的成熟则由另一个不翻译的RNA小分子(RNAI)所控制.RNAI编码RNAⅡ的同一区段的DNA的互补链转录而来,它可与RNAⅡ结合,并阻止RNAⅡ折叠为三叶草结构,而三叶草结构对于形成稳定的DNA—RNA杂交体又是必不可少的。
一个只有63个氨基酸的小蛋白(Rop蛋白)可以增强RNAI和RNAⅡ的结合,这一蛋白由位于复制起点下游400个核苷酸处的基因所编码.Rop蛋白强化了RNAI对复制的负调节作用(图)。
图带pMB1(或ColE1)复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小
因此,可削弱RNAI和RNAⅡ之间相互作用的突变,将会增加带有pMB1复制子的载体的拷贝数。
。
这些突变位于rop基因区或编码RNAI和RNAⅡ的复制起点上游区内。
例如,pUC质粒之所以拷贝数较高,是因为在RNAI的正常起始位点上游1个核苷酸的位置带有G—A突变,结果RNAI转录物的起始位点位于正常起始位点下游3个核苷酸的位置。
RNAI5’—端的完整对于RNAI和RNAⅡ间的相互作用至关重要。
因此,pUC质粒拷贝数的增加看起来很可能是由缩短的RNAI和RNAⅡ结合效率降低所致。
除了控制拷贝数以外,质粒上编码RNAI、RNAⅡ和Rop蛋白的区段也决定两个不同的质粒是否可以在同一个细菌细胞中共存。
利用同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处,可以称之为不相容质粒.当两个上述质粒被导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中会彼此竞争。
由于质粒是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的,所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不是总能保持相同。
最初在随机过程中产生的微小差异,将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。
在一些细胞中,一种质粒处于优势;而在另一些细胞中,与之不相容的另一种质粒却占尽上风。
细菌生长几代后,占少数的质粒将会丧失殆尽,在原始细胞的后代中可能含有两种质粒的任意一种,但不会兼而有之。
在分子克隆的所有操作中最基本的或许要算核酸的分离纯化,分离纯化核酸总的原则是:
①应保证核酸的一级结构完整性;②排除其他分子的污染。
为了保证对核酸结构与功能的研究,完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构中。
核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及其和其他大分子结构结合的方式。
核酸的纯化方式应符合以下三个条件:
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;②其他生物大分子(如蛋白质、多糖和脂类分子)的污染应降低到最低程度;③排除其他核酸分子的污染,如提取DNA分子时,应去除RNA分子,反之亦然。
为了保证分离核酸的完整性和纯度,在实验过程中,应注意以下事宜。
①
尽量简化操作步骤、缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏。
②减少化学因素对核酸的降解,为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH4~10的条件下进行.③减少物理因素对核酸的降解,物理降解因素主要是机械剪切力,其次是高温。
机械剪切力的主要危害对象是大分子量的线型DNA分子,如真核细胞的染色体DNA;对分子量小的环状DNA分子,如质粒DNA及RNA分子则威胁相对少一些。
高温(如长时间的煮沸)对核酸的完整性有很大破坏,除水沸腾带来的剪切力外,高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。
核酸提取过程中,常规操作温度为0~4℃,此温度环境可降低核酸酶的活性与降解反应速率,减少其对核酸的生物降解。
④防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶会降解核酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构。
其中DNA酶需要二价金属离子Mg2+、Ca2+的激活,使用二价金属离子螯合剂EDTA、柠檬酸盐基本上可以抑制DNA酶的活性。
不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同,一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准。
①所得的DNA的纯度应满足下游操作的要求,用于RFLP分析的DNA,其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交;用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物,PCR过程对模板的要求不是很高,模板不需要达到超纯。
大量的实验数据表明,存在一定量的蛋白质或SDS等对实验过程影响不大,所以只要没有交叉污染,模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用DNA的制备那样严格。
但在DNA模板中,不能有影响扩增反应的物质存在。
例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等;另一类是尿素、十二烷基磺酸钠、卟琳类物质等;还有一类是二价金属离子的螯合剂(如EDTA等),会与镁离子络合,影响TaqDNA聚合酶的活性。
上述物质的存在会影响扩增效果,甚至使扩增失败。
②所得的DNA应当完整,电泳检查时应能得到精确性高、重复性好的迁移带型.③所得DNA应有足够的量。
因此,核酸提取的主要步骤不外乎破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,沉淀核酸,去除盐类、有机溶剂等杂质,纯化核酸等。
核酸提取的方案,应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定,然而一些核酸纯化和浓缩的基本方法都是一致的。
核酸纯化的关键步骤是去除蛋白质,通常只要用苯酚-氯仿和氯仿抽提核酸的水溶液即可。
每当需要把克隆操作中的某一步所用的酶灭活或去除以便进行下一步操作时,即可进行这种抽提。
然而,如果要从细胞裂解液等复杂的混合物中纯化核酸,则需要增加一些处理措施。
这些情况下,通常先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质,然后再用有机溶剂抽提。
这些广谱的蛋白水解酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等,它们对多种天然蛋白均有活性.
从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用苯酚-氯仿抽提,然后再用氯仿抽提,这是因为使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。
此外,苯酚虽能有效地使蛋白质变性,却不能完全地抑制RNA酶的活性,而且它还能溶解带有长poly(A)的RNA分子。
使用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合液可使这两个问题迎刃而解.然后再用氯仿抽提则可去除核酸制品中残留的痕量苯酚。
应用最为广泛的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。
在中等浓度单价阳离子存在下形成的核酸沉淀物,可通过离心进行回收并按所需浓度重新溶解于适当的缓冲液中。
这一技术不但快速,而且对含量极低(皮克级)的DNA和RNA也可定量回收。
主要的可变因素包括以下三个。
(l)形成沉淀的温度在0℃且没有载体存在的情况下,浓度低至2Ong/mL的DNA也能形成沉淀,用微量离心机进行离心即可定量回收。
(2)在沉淀混合液中使用的单价阳离子的类型和浓度常用于沉淀核酸的阳离子及其浓度表,其选择很大程度上取决于人们的习惯.
表常用于沉淀核酸的阳离子及其浓度
提供阳离子的化合物
贮存液浓度/mol·L-1
终浓度/mol·L-1
乙酸铵
LiCl
NaCl
乙酸钠
10.0
8。
0
5.0
3。
0
2.0~2。
5
0。
8
0.2
0.3
乙酸铵常用于减少dNTP的共沉淀。
例如,在2mol/L乙酸铵存在下连续沉淀两次,可从DNA制品中除去99%的dNTP.但是,如果沉淀的核酸将要用于磷酸化则不能使用乙酸铵,因为铵离子会抑制T4噬菌体多核苷酸激酶的活性。
若用较高浓度的乙醇沉淀核酸,例如在沉淀RNA时,常用LiCl。
LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。
如果沉淀的RNA将用于无细胞翻译或反转录过程,则应避免使用LiCl。
在大多数无细胞体系中,氯离子可抑制蛋白质合成的起始,也抑制依赖于RNA的DNA聚合酶活性。
由于不同大小的RNA在高浓度LiCl中的溶解度各不相同,故LiCl可用于选择性地纯化大分子RNA。
含有SDS的DNA样品应使用NaCl(0.2mol/L)进行沉淀,这时去污剂在70%的乙醇中仍保持可溶状态。
DNA和RNA的沉淀大多使用乙酸钠(0。
3mol/L,pH5.2).
(3)离心的时间与速度在没有载体DNA的情况下,用微量离心机于0~4℃以1200×g离心15min,可定量回收含量低于20ng/mL的核酸。
然而,处理更低浓度的DNA或较短(少于100个核苷酸)的片断时,则应延长离心时间以使核酸沉淀紧贴于离心管上.
用微量离心机离心以后,并非所有的DNA都聚集于管底,多达50%的DNA可附着于管壁上。
要回收所有的DNA,就必须要用液滴来回冲洗管壁的相应扇面。
可使用1倍体积的异丙醇代替2倍体积的乙醇来沉淀DNA
,使用异丙醇的优点是待离心的体积较小。
但是,异丙醇的挥发性比乙醇低,因而更难去除.此外,使用异丙醇时,蔗糖或氯化钠等溶质更容易与DNA共沉淀。
一般来说,乙醇沉淀更受青睐,只有必须尽量减少溶液体积时除外。
提取质粒DNA有多种方法,所有这些方法都包括3个基本步骤:
培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。
可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞壁裂解。
经溶菌酶和SDS处理后,在碱性条件下,细菌染色体DNA和质粒DNA都变性,而闭环的质粒DNA由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当加人乙酸钾等物质(在中性条件下)时,巨大的染色体DNA分子难以复性,而质粒DNA很快得以复性.同时,在高盐浓度的条件下,宿主染色体DNA、蛋白质等形成不溶性网状结构,通过离心可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,而质粒DNA仍留在上清中,然后采用异丙醇或乙醇沉淀可得到质粒DNA。
通常在DNA样品的分析中,往往通过测量OD值来确定其浓度.DNA的吸收峰在260nm处,蛋白质的吸收峰在280nm处。
用标准样品测得,在波长260nm下,1μg/mLDNA钠盐溶液的OD值为0。
02,即在OD260=1时,双链DNA含量为50μg/mL,单链DNA与RNA含量为40μg/mL,寡聚核苷酸的含量为30μg/mL(由于底物不同而有差异)。
这些标准数据使人们能定量测定核酸,但是当核酸的G-C百分含量发生较大变化时,也会导致这些数据的偏差。
紫外分光光度法除可以测定核酸的含量外,还可以测定核酸的纯度。
已知核酸在260nm处有碱基引起的强吸收峰,230nm处有一吸收低谷,蛋白质在280nm处有一个由酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸引起的吸收峰,所以OD260/OD280的值能说明蛋白质对核酸的污染程度。
一般认为纯净DNA的OD260/OD280约为1。
8,而纯净RNA的OD260/OD280约为1.8~2。
0,样品中若含有蛋白质,会使OD260/OD280的值下降。
当OD260/OD280小于1。
75时,该样品可适当稀释,用氯仿-异戊醇抽提,重新用无水乙醇沉淀后再进行测定。
当DNA样品的OD260/OD280大于2时,则RNA浓度过高,需要去除RNA。
但这样的评估对于不纯的样品没有意义,因为若DNA同时含有蛋白质和RNA也会使比值落在1。
8左右,这时应进行电泳鉴定,以排除蛋白质和RNA同时存在的可能性.此外,还可以辅以OD230测定,
OD260/OD230的值应大于2.0,小于该值时表明样品中有残存的盐和小分子杂质。
所提取的质粒DNA可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
一般情况下,提取的质粒为3条带(图).在细胞内,质粒DNA是共价闭环DNA(covalentlyClosedcircularDNA),常以超螺旋形式存在。
如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫作开环DNA(opencircularDNA);若两条链在同一处或相近的部位断裂,则变成线性DNA分子。
在电泳时,同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异,其速度从大到小的次序为:
cccDNA>线性DNA>ocDNA,共价闭环DNA
的泳动速度最快。
但在优化条件下,如在冰浴中或用试剂盒提取时,可以只出现一条带或主要出现一条带,即超螺旋带.
图质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图
M-λHindⅢ;1,2,3,4—pBI121;5,6-pActlIsGFP—1
提取的质粒DNA经RNase消化后,可直接使用或经进一步纯化后用于其他分子生物学实验。
纯化后的质粒DNA可用分光光度计检测其纯度和浓度。
本实验采用碱裂解法小量提取质粒DNA,包括载体质粒DNA和重组质粒DNA,用于进一步的转化、酶切和PCR等实验。
2。
目的
掌握质粒DNA的提取和检测方法。
3.主要试剂和材料
(1)LB液体培养基胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl10g/L,pH7.0.
(2)STE溶液0.lmol/LNaCI,10mmol/LTris-Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8。
0)。
(3)溶液I50mmol/L葡萄糖,25rnmol/LTris-Cl(pH8。
0),10mmol/LEDTA(pH8。
0)。
(4)溶液Ⅱ0。
2mol/LNaOH,l%SDS;使用前用0.4mol/LNaOH和2%SDS等量混合.
(5)溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11。
5mL,水28。
5mL。
(6)TE10mmol/LTris-Cl(pH8。
0),lmmol/LEDTA(pH8。
0).
(7)其他氯仿-异戊醇(24:
1),无水乙醇,70%乙醇。
4主要仪器设备
恒温摇床,离心机,涡旋振荡器,微量移液器,水浴锅。
5。
实验步骤
(1)从选择性培养平板上挑取单菌落,移至含有相应抗生素的LB
液体培养基中,于37℃振荡培养过夜(不要超过16h)。
(2)将1.4mL培养物移至1。
5mL离心管中,12000r/min离心lmin。
(3)弃上清(一次性地将液体倒出,并用滤纸吸净管口残余的液体,尽量避免液体重新流回管底),用lmLSTE溶液重悬细菌沉淀,12000r/min离心lmin。
(4)弃上清,细菌沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液I中(注意:
重悬时应使细菌沉淀完全分散)。
(5)加入200μL新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混匀内容物,之后将离心管置于冰上2min(注意:
混合的动作要温和).
(6)加入150μL用冰预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,颠倒使之混匀,之后将离心管置于冰上10min。
(7)4℃、12000r/min离心5min,将上清转移到另一离心管中。
(8)加入等体积的氯仿一异戊醇(24︰1),颠倒混匀5min,12000r/min离心5min。
(9)将上清移入另一离心管中,加入冰预冷的2倍体积的无水乙醇,颠倒混匀,于冰上放置l0min。
(10)4℃、12000r/min离心10min。
(11)小心弃去上清,加入lmL70%乙醇洗涤DNA沉淀(可使沉淀脱离管壁).
(12)4℃、12000r/min离心10min。
(13)小心弃去上清,室温放置使乙醇挥发或在超净工作台内吹干沉淀(约需20~30min),沉淀呈半透明状闻不到乙醇的味道时即可,不可过于干燥。
(14)将沉淀溶于50μL灭菌的TE或ddH2O中,取5μL进行电泳观察并照相.
(15)加入RNase(终浓度20~50μg/mL),37℃消化40min,取5μL进行电泳观察并照相.此时DNA溶液可保存于4℃或-20℃下以用于酶切和PCR反应等,如需要进一步纯化,则继续完成以下实验步骤。
(16)加水将体积补至400μL,重复步骤(8)~(13)(注意:
在第(9)步加人无水乙醇以前要按照表3—3的要求加人一定量的盐)。
(17)将沉淀溶于2μL灭菌的TE或ddH2O中,取5μL进行电泳观察并照相。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 精品 质粒 DNA 提取 检测