端粒酶活性检测方式的研究进展.docx

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端粒酶活性检测方式的研究进展

端粒酶活性检测方式的研究进展

　　摘要:

近几年研究说明端粒酶与肿瘤的发生进展紧密相关，推测可能是一个普遍的肿瘤标志物。

本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方式，TRAP扩增技术，四种结果分析方式（同位素法、染色法、荧光法和ELISA法）和如何进行质量操纵与半定量测定进行综述。

　　端粒酶（Telomerase）是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。

人端粒酶RNA组分（hTR）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-CUAACCCUAAC-3′）；蛋白质组分具有RNA依托的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。

端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。

在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发觉绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个普遍的肿瘤标志物[1]。

因此近几年端粒酶在各类肿瘤中的研究日趋深切，同时增进了检测方式的改良与完善。

本文对其检测方式综述如下。

　　1大体原理

　　端粒酶在体外能够以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的结尾添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳可显示6个碱基不同的梯带。

1994年Kim成立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法（telomericrepeatamplificationprotocol,TRAP）。

TRAP反映原理见以下图。

　　第一合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS结尾的GTT并合成agggttag，然后每通过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，通过量次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

　　2大体技术方式

　　标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。

　　端粒酶的提取方式初期采纳超声等物理破碎的方式在不同细胞中的提取效率不同较大，尔后采纳去污剂（如CHAPS）裂解的方式在少量细胞获取了较稳固的端粒酶提取液。

现详述如下：

40～100mg冷冻（-70％℃）组织或104～106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mMhepes-KOH,MgCl2,10mMKCI,1MmDTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mMtris-HCI,1mMMgC12,1mMEGTA,PMSF,5mMβ-巯基乙醇，％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min,16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部份样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保留。

端粒酶经小于10次冻融可维持活性稳固。

部份学者对某些标本用％Tween-20代替％CHAPS取得更好的成效[2]。

　　TRAP扩增50μlTRAP体系包括20mMtris-HCI，MgCI，63mM,KCI,％Tween-20，1mMEGTA,50μMdNTP，μgtS，1μgT4基因32蛋白，ml牛血清白蛋白，1～2μlCHAPS细胞提取液（含6μg）蛋白，～μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP（10μCi/μl,3000Ci/mmol），这一反映体系可同时知足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，23℃10min合成端粒酶延伸产物后，94℃3s灭活端粒酶，加入μgcX和2UTaq酶，94℃30s，50℃30s，72℃扩增27个循环，25μl产物进行15％PAGE凝胶电泳。

　　引物设计为了避免上、下游引物之间的结合，在CX引物上设计了3个不匹配碱基（见图1*处），单链结合蛋白T4基因32蛋白可进一步幸免引物之间的结合，TS和CX引物被广为采纳，在上述条件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片断才有特异扩增，即取得从40bp开始的6bp不同的梯带。

Broccoli等以5′-GGCGCG（ACCCTA）3-3′代替CX引物，由于增加了G-C含量，可提高退火温度，进一步幸免引物间的结合，增加特异性[3]。

Oncor公司设计RP引物代替CX引物，取得从50bp开始的6bp不同的梯带[4]。

　　3扩增片断的检测

　　同位素法Kim成立的方式即为同位素法，其应用最多。

采纳[α-32P]dGTP或dCTP掺入的报导很多，但部份学者用[γ-32P]dATP和T4激酶标记TS引物的5′端，发觉更易于检出低水平的端粒酶，同时更易定量[3,5]。

PAGE凝胶电泳后在X-光片上放射自显影或用Phosphoimager仪扫描测定3h。

同位素法的优势是灵敏度高，100个永生化细胞27个循环即可检出，缺点是存在放射性污染，且放射自显影需8h至两天以上时刻，时刻较长。

　　染色法电泳后用SYBRgreen或EB染色，然后紫外灯下观看或用CCD图像系统测定[4,6,7]。

EB在302nm紫外透射仪和桔红色紫外滤光片下成效最好，可得与SYBRgreen相近的灵敏性。

染色法简便，快速，灵敏度为100个永生化细胞30个循环，由于染色带的信号强度不能精准反映其分子数（大片断染色更强），因此染色法只能判定相对端粒酶活性，而不能测定端粒酶延伸产物的确切数量。

　　荧光法加入10pmol荧光素标记（如FAM，FITC）的TS和/或CX引物扩增，经8％的变性PAGE凝胶电泳，DNA测序仪自动读取数值，片断治理系统软件自动计算扫描曲线的峰高和峰面积，从上样到出结果仅需90min。

荧光系统极灵敏，为幸免过量扩增产物可能给出不靠得住结果，要利用～μg的低蛋白量，扩增27个循环，由于片断治理系统能自动检出很微弱的荧光，因此不能精准测定低水平端粒酶活性[8～11]。

荧光法的另一应用是于原位—TRAP分析，能够在细胞水平上检出端粒酶活性，因此能够判定是哪些细胞、多少细胞具有端粒酶活性，而裂解提取法不能知其活性的细胞来源。

原位分析在硅化玻片上进行，荧光显微镜下观看结果。

目前只用于新鲜标本，用冻存病理标本的实验尚不成功，需改良方式避免冻融中胞内端粒酶的分散及增加标本的渗透性等[12]。

　　ELISA法TS引物5′端标以生物素，PCR扩增后，将产物变性，加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片断特异结合的探针，杂交产物上的生物素与固定在微孔板上的卵白素相结合，而探针上的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体结合，然后加入底物，显色后用酶标仪测定。

ELISA法是宝灵曼试剂盒利用的方式，由于没有电泳，因此观看不到6bp不同的梯带。

　　4质量操纵

　　排除假阳性设置以下四种对照

（1）85℃10min灭活端粒酶；

（2）端粒酶对RNase灵敏，μg/10μl提取液＋1μgRNase，37℃，20min；（3）不加提取液；（4）不加CX或TS引物。

以上实验可排除引物二聚体或PCR污染。

　　排除假阴性

（1）以阳性细胞沉淀（106细胞）的裂解提取液为阳性对照进行TRAP分析能够排除由于试剂质量不行造成的假阴性。

（2）组织提取液中Taq酶抑制物的存在会造成假阴性，为此Wright等加入一个150bp的内标准。

内标准的取得方式如下：

设计TS加长引物：

5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC-3′和CX加长引物：

5′-（CCCTTA）3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-3′，别离在TS和CX引物的3′端增加15个碱基，可与编码鼠肌蛋白的97～132位氨基酸的碱基匹配，扩增后取得150bp产物，柱纯化后备用。

每一个TRAP反映加入15ag内标为模板，TS和CX引物既可扩增端粒酶延伸产物，又可扩增150bp的内标，当无150bp扩增带显现时说明存在Taq酶抑制剂，这对内标为众多学者所采纳。

也有其它学者采纳200bp或36bp的内标[4,8,14]。

（3）稀释提取液可降低酶抑制物浓度，扩增带从无到有说明含酶抑制物。

为了减少乃至排除某些标本中存在的抑制物的阻碍，许多学者在取得端粒酶延伸产物后进行酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）抽提，酒精沉淀纯化[14,15]。

　　5端粒酶活性的半定量检测

　　由于端粒酶活性在少数正常组织细胞中有微弱的表达，而且与细胞的增殖活跃程度、肿瘤的恶变程度及预后等有关，因此半定量测定端粒酶活性在临床应用上意义重大。

简便的方式是通过10倍稀释提取液以有无6bp不同的梯带产物为标准。

在任何稀释度下无产物为（-）；不稀释下有产物为（+）；10倍稀释下有产物为（++）；100倍稀释下有产物为（+++），还可再进行1000倍稀释[16～18]。

Wright等将内标引入后使端粒酶活性的半定量检测成为可能，将6bp不同的梯带强度总和和除之内标的强度进行标准化后，在10～11000个细胞间具有专门好的线性关系，而无内标时在大于300个细胞即进入平台。

许多学者采纳这种方式描述相对端粒酶活性[18,19]。

Oncor试剂盒（1996年第2版）提供了更为准确的方式，用Phosphoimager仪扫描测定凝胶信号，TPG（TotalproductGenerated，总生成产物）单位＝（（x-x0）/c）/（（r-r0）/c）×100（TSR8为，其中x代表无热灭活处置标本管中梯带信号总和；x0代表热灭活管信号；r代表TSR8质控管梯带信号总和，TSR8是人工合成的寡核苷酸链，由于TS连接AG（GGTTAG）7组成；r0代表无标本的裂解液对照管信号；c和cR别离代表无热灭活处置标本管和TSR8质控管中内对照的信号，每一个TPG单位相当于1×10-3amol或600个TS引物分子30℃，10min延伸至少4个端粒重复序列的数量，在1～300TPG（相当于约30～10000个阳性对照细胞中所含端粒酶活性）范围内成线性。

　　5小结

　　kim成立了TRAP方式为端粒酶活性的检测提供了一个有力的手腕，尔后许多学者又进行了改良，尤其是内标的引入使得借助某些分析仪能够进行较精准的半定量测定。

四种结果分析方式中，同位素法灵敏度高，但存在放射性污染，临床推行有必然难度；荧光法虽需入口的珍贵仪器，但其灵敏、快速、自动化程度最高，且易于半定量；染色法和ELISA法简便、快速，结合稀释法能够进行简单的半定量，后三种方式均有应用前景。

　　参考文献

　　1KimNW,PiatyszekMA,prowseKR,etal.Science,1994；266:

2020

　　2MiuraN,HorikawaI,nishimotoA,etal.CancerGenetCytogenet,1997；93:

56

　　3BroccoliD,YoungJW,langeT,etal.CellBiol,1995；92:

9082

　　4BrienTP,KallakuryBV,lowryCV,etal.CancerRes,1997；57:

2760

　　5ChadeneauC,HayK,HirtehW,etal.CancerRes,1995；55:

2533

　　6PaoBC,TsengCJ,LinCY,etal.JClinOncol,1997；15:

1932

　　7KyoS,TakakuraM,ishikawaH,etal.CancerRes,1997；57:

1863

　　8HeineB,HrmmelM,Mllerm,etal.JPathol,1998；184:

71

　　9OhyashikiJH,Ohyashikik,SanoT,etal.JpnJCancerRes,1996；87:

329

　　10SudaT,IsokawaO,aoyagiY,etal.Hepatology,1998；27:

402

　　11IwamaH,OhyashikiK,ohyashikiJH,etal.HumGenet,1998；102:

39712OhyashikiK,OhyashikiJH,nishimakiJ,etal.CancerRes,1997；57:

2100

　　13WrightWE,ShayJW,piatyszekMA,etal.NucleicAcidsRes,1995；23:

3794

　　14LinnJE,LangoM,halachmiS,etal.IntJCancer,1997；57:

2144

　　15UmbrichtCB,SajiM,westraWH,etal.CancerRes,1997；57:

2144

　　16LinY,VemuraH,fujinamiK,etal.JUrol,1997；57:

1161

　　17KojimaH,YokosukaO,imazekiF,etal,JUrol,1997；157:

1161

　　18TsutsumiM,TsujiuchiT,ishikawaO,etal.JpnJCancerRes,1997；88:

931

　　19HiyamaE,KodamaT,shinbaraK,etal.CancerRes,1997；57:

326

　　20NakashioR,KitamotoM,taharaH,eual.IntJCancer,1997；74:

141