乳腺癌细胞培养.docx
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乳腺癌细胞培养.docx
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乳腺癌细胞培养
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可,10—15%的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基,加入0.25%的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2—5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。
需要注意的是MCF-7
生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。
MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称MDA-MB-231
物种人
细胞形态特征上皮样
细胞生长特性贴壁生长
细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。
该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受
体和WNT7癌基因
培养基L15:
LeibovitzMedium
血清10%FBS
细胞传代方法1:
2~1:
4传代;每周2~3次
细胞传代情况C5
细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基
+5%DMSO+20%FBS
支原体检测阴性
说明
培养基:
DMEM90%,FetalBovineSerum10%
培养条件:
37C5%CO2
消化条件:
0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA溶液,消化5-10min
传代的比例:
1:
2~1:
4
换液时间:
2~3天换液一次
冻存液比例:
85瞬养基,10%FBS,5%(v/v)DMSO
冻存密度:
1-2X106/管,液氮保存
MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法:
取出冻存管后,投入37C水浴中,震荡解冻2min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5ml37C预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000rpm,5min),弃去上清液,再加入2ml培养基,转入培养瓶中培养。
产品名称:
人正常乳腺细胞Hs578Bst
规格:
70沁度的25cm2培养瓶的细胞一瓶
特点:
细胞代数为4-5代左右
包装:
内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说
明书
细胞来源:
ATCCsciencell、ICLC
货期:
1-2周
运输方式:
快递运输
售后:
收到细胞后7天,如发现细胞有质量问题(如污染,死亡,快递运输等原因)时,应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员,我们将尽快为您解决。
细胞培养常见问题分析
细胞培养
1、冷冻管应如何解冻?
取出冷冻管后,须立即放入37C水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除DMSO
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮
性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSC即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基?
不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类?
不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类
和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清,在
一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成
细胞无法存活。
5、何谓FBS,FCS,CS,HS?
FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同
的意思,两者都是指胎牛血清,FCS乃错误的使用字眼,请不要再
使用。
CS(calfserum)则是指小牛血清。
HS(horseserum)则是指马血清。
6、培养细胞时应使用5%或10%C02或根本没有影响?
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHC03的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
当培养基中NaHC03^量为每公升3.7g时,细胞培养时应使用10%CO2当培养基中NaHC03为每公升1.5g时,则应使用5%CO2培养细胞。
7、何时须更换培养基?
视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更
换培养基即可。
8培养基中是否须添加抗生素?
除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度?
应如何处理?
一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。
次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于-20C,避免反复
冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理?
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。
分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培
养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?
欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg(约1,000rpm),5-10
分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。
12、细胞之接种密度为何?
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。
细胞
数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基之成份为何?
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO
(dimethylsulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养
基均匀混合之。
注意:
由于DMSO稀释时会放出大量热能,故不可将
DMSO直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。
14、DMSO之等级和无菌过滤之方式为何?
冷冻保存使用之DMSO等级,必须为Tissueculturegrade之DMSO
(如SigmaD2650,其本身即为无菌状况,次开瓶后应立即少量分
装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。
若要过滤DMSO则须使用
耐DMSO之Nylon材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法?
冷冻保存方法一:
冷冻管置于4C30~60分钟-(-20C30分钟*)f-80°C16~18小时(或隔夜)f液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二:
冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟
降1-3C至-80C以下,再放入液氮槽vaporphase长期储存。
*-20C不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦
可跳过此步骤直接放入-80C冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
15、细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial,融合瘤细胞则以
5x106cells/mlvial为宜。
16、应如何避免细胞污染?
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之方法。
17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?
加入相应抗生素。
直接灭菌后丢弃之。
18、支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状?
不能。
除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
19、支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数
据。
故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
20、CO2培养箱之水盘如何保持清洁?
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
21、为何培养基保存于4C冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性?
培养基保存于4C冰箱中,培养基内之C02会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)
的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2以调
整pH值。
22、各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?
不同厂牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程
序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。
23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?
购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:
培养基使用错误或培养基品质不佳。
血清使用错误或血清的品质不佳。
解冻过程错误。
冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。
悬浮细胞误认为死细胞。
培养温度使用错误。
细胞置于-80C太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?
冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。
另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
25、如何选用特殊细胞系培养基?
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞,很可
能在DME或M199中同样很容易生长。
总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养首选AIMV(12005)培养基(SFM。
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?
它在溶液中不稳定吗?
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。
脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。
L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
27、GlutaMAX-l是什么?
培养细胞如何利用GlutaMAX-l?
这个二肽
有多稳定?
GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。
一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺
供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰
胺几乎完全降解。
28、什么培养基中可以省去加酚红?
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:
中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。
研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。
为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。
由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?
使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。
EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。
建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA青洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
31、书上说,Hank's平衡盐溶液(HBS要在空气中使用,不需要
CO2培养箱。
原因是什么?
Hanks平衡盐溶液(HBS和Earle‘s平衡盐溶液(EBS有什么本质的功能差别?
HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。
碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。
Eagles液在空气水平的CO2中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。
如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。
如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。
(学习的目的是增长知识,提高能力,相信一分耕耘一分收
获,努力就一定可以获得应有的回报)
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- 乳腺癌 细胞培养