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PCR常见问题资料
竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。
操作步骤如下:
(1)将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体。
洗涤。
(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原医学教丨育网整理的混合溶液,使之与固相抗体反应。
如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。
如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。
参考管中只加酶标抗原,保温后,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。
洗涤。
(3)加底物显色:
参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。
参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。
待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多
1包被抗原,酶标二抗进行的间接竞争法2包被抗原,酶标一抗进行的标记抗体直接竞争法3包被抗体,标记抗原进行的标记抗原直接竞争法,
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
双抗体夹心法
一、将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
二、加受检标本:
使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
三、加酶标抗体:
使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
四、加底物:
夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量
根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
双向扩散试验沉淀线的形态和位置的4种分析
1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估计 沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致。
沉淀线如靠近抗原孔,则指示抗体含量较大;如靠近抗体孔,则指示抗原含量较多。
不出现沉淀线则表明抗体或抗原过剩。
另外,如出现多条沉淀线,则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。
因此,可用于鉴定抗原或抗体的纯度。
双扩散各种孔型图
2.抗原或抗体相对分子量的分析 抗原或抗体在琼脂内自由扩散,其速度受分子量的影响。
分子量小者扩散快,反之则较慢。
由于慢者扩散圈小,局部浓度较大,形成的沉淀线弯向分子量大的一方。
如若两者分子量相等,则形成直线。
图显示左侧沉淀线抗原分子量大于抗体,右侧沉淀线则抗体大于抗原,中间一条线则为两者相等。
抗体多为IgG,分子量约15kD,未知抗原的分子量可做粗略估计。
抗原抗体相对分子量示意图
3.用于抗原性质的分析 两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。
三种情况在双向扩散中表现的基本图形见图
三种双扩散基本图形
从图可以分析出,左图中两种受检抗原(Ag-a)完全相同,形成一个完全融合的沉淀线;右图中抗体为双价,两种抗原完全不同(Ag-a和Ag-c);中图的抗体为双价,两种抗原(Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位,又有不同的b和c表位,所以沉淀线呈部分融合的形状。
这种技术作为抗原的分析,是目前免疫化学中最常用的鉴定技术之一。
4.用于抗体效价的滴定 双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。
固定抗原的浓度、稀释抗体;或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释,经过自由扩散,形成沉淀线。
出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。
免疫电泳是指一定量可溶性的抗原物质与相应抗体借用琼脂糖为载体在一定电场强度下以合适的比例加速结合形成复合物,并以沉淀线(或峰)的形式表现出来,通过观察和分析沉淀线(或峰)的性质而对抗原抗体进行定性定量。
该技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。
这种技术有两大优点,一是加快了沉淀反应的速度,二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开,再分别与抗体反应,以此做更细微的分析。
免疫电泳技术的种类很多,这里仅将常用的技术介绍如下。
电泳的基本原理
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳装置主要包括两个部分:
电源和电泳槽。
电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。
电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。
垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离
带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离,如等电聚焦电泳;而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离,如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分离后的样品通过各种方法的染色,或者如果样品有放射性标记,则可以通过放射性自显影等方法进行检测.
琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响
1、DNA的分子大小及构型
不同构型DNA的移动速度次序为:
供价闭环DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。
当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
分离小于0.5kb的DNA段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、电源电压
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好。
在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。
但是,在电场强度增加时,不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA段的分辨率达到最大电场强度不宜高于5V/cm。
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
质粒完整的话可以形成超螺旋结构,跑最快;如果有部分单链断裂,还是可以保持环状,但是无法超螺旋,要跑慢一点;如果双链锻裂,变成线性分子,就跑最慢。
电泳出现拖尾现象,英文成为smear,就是弥散。
其原因,主要从以下两个方面考虑:
1、PCR产物自身原因:
往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多,而造成PCR的非特异性产物过多。
对策:
①减少Taq酶的量,或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量,减少引物的用量,减少循环次数,提高退火温度。
2、电泳体系的问题:
(1)电泳缓冲液TAE或者TBE的污染,建议更换缓冲液。
(2)上样时样品漂了,建议增加上样缓冲液的用量,以及小心加样。
(3)电压太高。
(4)适当把你的胶的浓度加大。
(根据你的片断大小而定)(5)观察你的marker是否也存在拖尾现象,作为对照。
引物
你是想扩基因还是启动子啊?
一般基因的话,你可以用亲缘关系比较近的物种的该基因的序列设计引物,序列可以在NCBI上查到的,如果是启动子,就可以采用接头PCR,或者是设简并
引物来扩,方法很多的
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