狐狸酶活的研究.docx
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狐狸酶活的研究
狐狸主要消化酶变化规律的研究
小肠是碳水化合物、蛋白质及脂肪等营养物质的主要消化场所。
小肠液中消化酶的活性可能是影响采食、消化及生长的主要限制因素[1-2]。
在研究胃肠道消化酶的试验中,由于消化液的分泌、胃肠道的蠕动等环境温度[3]及摄食行为[4]的影响,消化酶的活性呈现某些规律性波动。
胃肠道的消化能力在狐的生长过程中起着极其重要的作用。
但是,仔狐在前期消化能力很有限,原因是消化道发育不成熟和消化酶分泌不足,只能靠母乳提供生长所需的营养物质。
本文通过对不同断奶日龄仔狐在断奶前后主要消化酶活性测定,探讨不同日龄仔狐酶活发育规律,从而为仔狐营养需要奠定理论基础。
1.试验材料和方法
1.1试验动物
试验动物采用相同饲养管理条件下、发育正常、健康的初生(1d),7d、14d、21d、28d、35d、42d的蓝狐和银狐(每日龄各4只),所有试验动物均由唐山市狐狸养殖场提供,集中屠宰。
样品采集制备依照Owskzy的方法修改完成。
开腹后立即结扎幽门瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止样品相互污染,摘取胰脏,剥除脂肪组织和结缔组织;取含内容物的各肠段,将其中的内容物和肠粘膜刮出样品放入液氮中速冻,-70℃冻存备用。
1.2样品前处理
肠内容物:
取出冷冻的小肠内容物,自然解冻后,肠道食糜按WN=1/5加入冰上预冷至4℃的去离子水,匀浆,匀浆玻璃管外设冰浴,匀浆液用冷冻离心机4℃12000r/min离心15min(5ml),取上清液等分成若干份贮存在-30℃冰柜中保存,以备进行酶活性分析。
胰脏:
解剖后在冰盒冷却的铁板上迅速截取胰脏,生理盐水冲洗后干纱布蘸干水分,秤重并记录,立即放入液氮速冻后,转移至-70℃保存。
胰腺上清液的制备:
从冰箱中取出的胰腺,用其重量的11倍体积的4℃的去离子水匀浆45秒,匀浆玻璃管外设冰浴。
匀浆液在4℃下离心15Smin(16000r/min),将上清液置-20℃下保存,用于酶活性测定。
胰腺酶原的激活:
配制O.O5mol/1Tris-HCL(pH=7.10)的缓冲液,内含有0.05mol/LCaCL2。
将肠激酶溶解在Tris缓冲溶液中配成0.1%的肠激酶-Tris缓冲液,在胰腺组织上清液中加入等体积的肠激酶一Tris缓冲液,370C温浴1h。
即可激活胰蛋白酶原和糜蛋白酶原[5]。
1.3实验项目
肠道各段内容物及胰脏淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶、胃蛋白酶、乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性。
1.4测定方法及酶活定义
酶活定义及标准曲线的制备及具体测定方法见附录。
1.4.1淀粉酶的测定
依照Bernfeld的方法改进后完成。
用移液管将0.1ml小肠液移入一试管,并在水浴中调温至38℃,加入0.1ml已同样预热至38℃的底物溶液(1%淀粉磷酸缓冲液,pH6.9),3分钟后加入0.2ml显色剂溶液(含3,5-二硝基水杨酸),终止反应,置试管于沸水浴中5分钟,冷水流冷却后加2ml蒸馏水,用分光光度计于540nm处以空白为参比测定吸光度。
用0.1ml蒸馏水代替小肠液测定空白值。
1.4.2胰蛋白酶的测定
依照Bernfeld的方法改进后完成。
用移液管将1ml底物缓冲液(底物为苯甲酰-精氨酸-P-硝基苯铵盐酸盐(BAPNA),缓冲液为0.005mol/LTris缓冲液,内含CaCl2,ph7.8)移入一试管,加0.18ml蒸馏水,38°C水浴5分钟,加0.02ml小肠液,38°C水浴60分钟,用30%乙酸终止反应,在410nm处以空白为参比测吸光度。
用0.2ml蒸馏水代替小肠液测定空白值。
1.4.3胰糜蛋白酶的测定
测定方法同胰蛋白酶。
特异性底物为GPPNA(Sigma,62505)。
1.4.4脂肪酶的测定
取100ml三角瓶4个,每瓶加入1m10.025mol/L磷酸盐缓冲液和0.8m1聚乙烯醇橄榄油乳化液,至38℃水浴中保温5min,然后在两个瓶中各加入小肠液0.2ml,从加入小肠液开始精确计算时间,继续保温15min,取出后立即加入95%乙醇3m1,以停止酶作用,加入2滴酚酞指示剂,用0.005mo1/1NaOH标准液进行滴定。
另外两个瓶子不加小肠液,也继续保温15min后,立即取出,各加入3m195%乙醇,然后加入0.2ml小肠液,用0.005mol/LNaOH标准液进行滴定,作为对照。
1.4.5胃蛋白酶的测定
使用南京建成试剂盒进行测定。
1.4.6二糖酶的测定
使用南京建成试剂盒进行测定。
1.5数据处理
数据用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析,采用Duncan法进行多重比较。
2.试验结果
2.1幼狐不同日龄各部位淀粉酶活性变化
日
龄
胰腺
十二指肠
空肠
回肠
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
64.14±13.27a
19.61±4.26a
10.15±2.05a
11.96±1.26a
36.74±7.26a
30.63±5.27b
29.24±9.18a
54.42±17.69a
7d
193.08±46.37ab
56.83±10.66a
14.14±3.59a
13.05±2.61a
19.98±4.16a
18.61±5.63a
80.97±17.47b
30.82±9.29a
14d
374.20±59.33c
497.49±88.95c
19.67±2.59ab
13.78±2.44a
32.60±1.43a
33.53±12.02b
97.22±14.80b
40.60±12.19a
21d
300.42±73.49bc
302.08±49.49b
17.58±8.30ab
14.86±2.81a
24.66±8.66a
17.95±4.28a
81.93±15.24b
30.45±5.30a
28d
724.47±110.91d
1078.51±10.06e
35.17±3.76b
43.32±10.78b
14.74±1.11a
29.97±2.93b
100.42±16.96b
42.78±5.47a
35d
698.88±80.80d
1254.53±84.55e
26.65±2.00ab
94.53±11.95c
27.01±5.37a
30.27±6.83b
102.06±7.28b
103.87±26.15b
42d
1413.72±222.53e
20776.71±161.21f
115.28±24.85c
117.62±18.21c
168.06±45.54b
32.08±4.64b
288.76±46.48c
193.23±42.52b
由以上数据可以看出幼狐小肠和胰腺的淀粉酶活性随着日龄的增加而逐渐升高。
而且初生时胰腺的淀粉酶活性并不是最高,随后随着日龄的增加胰腺的淀粉酶活性迅速增加,在后期个日龄段活性最高,其次是回肠较高。
这说明不同部位淀粉酶活性不同,导致对日龄的消化率不同。
初生时蓝狐胰腺淀粉酶较低,说明此时胰腺发育尚不完善,淀粉酶的提供主要依靠原来母体。
蓝狐胰腺淀粉酶活性随着日龄的增加而增加,到42日龄时仍有增加趋势。
十二指肠淀粉酶活性1-21日龄时差异不显著(P>0.05),28日龄之后显著增加(P<0.05)。
空肠淀粉酶活性在28日之前没有显著差异(P>0.05),28日龄之后显著高于前期(P<0.05)。
7日龄回肠淀粉酶活性显著高于1日龄(P<0.05),7-28日龄增长缓慢,差异不显著(P>0.05),35日龄之后显著增加(P<0.05)。
银狐胰腺淀粉酶活性随着日龄的增加而增加,到42日龄时仍有增加趋势。
银狐的十二指肠和回肠淀粉酶活性在28日龄之前变化不大,各日龄间差异不显著(P>0.05),28日龄之后酶活显著增加(P<0.05)。
空肠在整个试验阶段淀粉酶活性的差异不大。
2.2幼狐不同日龄各部位胰蛋白酶活性变化
日
龄
胰腺
十二指肠
空肠
回肠
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
1.27±0.24a
1.67±0.22b
6.75±2.31b
6.34±0.14a
0.65±0.22a
0.11±0.03a
0.53±0.19a
0.24±0.10a
7d
1.65±0.22ab
0.91±0.29a
7.76±1.04b
6.35±1.60cd
3.31±0.84a
0.34±0.15a
1.69±0.18a
0.39±0.05a
14d
1.78±0.15b
1.01±0.35a
5.85±1.29b
7.63±1.42d
3.62±0.90a
0.43±0.04a
2.12±0.07a
0.46±0.05a
21d
2.04±0.12b
1.54±0.29b
9.68±1.48c
8.92±3.45b
6.50±0.51b
1.43±0.22a
7.42±1.12b
6.13±0.17b
28d
3.04±0.45c
1.79±0.17b
7.00±0.66b
7.59±1.48d
8.62±1.07bc
1.16±0.13a
15.41±2.15c
13.51±1.57a
35d
3.58±0.41d
2.51±0.03c
2.65±0.67a
7.66±1.45d
9.71±1.97c
13.92±1.82c
10.86±4.16c
13.79±0.55b
42d
4.16±0.35e
3.55±0.49d
2.32±0.38a
3.62±0.32bc
13.52±2.11d
11.51±1.42b
12.42±2.32d
13.43±0.93c
幼狐不同日龄胰蛋白酶活性不同,胰腺的胰蛋白酶活性要较肠道内胰蛋白酶的活性低,胰腺胰蛋白酶随着日龄的增加而逐渐增加。
其它部位两个物种之间呈现出不同的发育规律。
蓝狐胰腺胰蛋白酶活性随着日龄的增加缓慢增加,到42日龄时活性最高,为4.16U/ml。
十二指肠胰蛋白酶随着日龄的增加先增大后减小,在21日龄时达到最大,为9.68U/ml,随后逐渐降低。
空肠胰蛋白酶随着日龄的增加而增加,42日龄时酶活性最高,达到13.52U/ml。
回肠胰蛋白酶活性随着日龄的增加先增大后减小,在28日龄时最大,为12.42U/ml,35日龄时显著减少(P<0.05),42日龄时由于所增加,但仍小于28日龄。
银狐胰腺胰蛋白酶的活性先减小后增大,前期变化不大,28日龄之后显著增加,到42日龄时达到最大值,为3.55U/ml。
十二指肠胰蛋白酶活性先增加后减小,在21日龄达到最大,为8.92U/ml,随后活性逐渐降低,到42日龄时为3.62U/ml。
空肠胰蛋白酶活性随着日龄的增加而增加,1-28日龄增加缓慢,差异不显著(P>0.05),35日龄显著增加(P<0.05),42日龄时又有所降低,为11.51U/ml。
回肠1-14日龄逐渐增加,但是差异不显著(P>0.05),21-28日龄显著增加(P<0.05),随后变化趋于平缓。
2.3幼狐不同日龄各部位脂肪酶活性变化
日
龄
胰腺
十二指肠
空肠
回肠
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
547.3±83.0a
2884.8±251.1b
184.5±65.8a
141.0±9.9a
139.0±21.2a
153.0±21.2a
225.0±30.6a
139.5±4.9a
7d
778.3±126.5ab
1284.3±185.7a
284.5±79.9ab
192.0±50.9ab
177.0±23.0b
266.0±19.3c
273.0±46.3ab
153.0±12.5a
14d
1113.8±139.5b
4347.8±155.1c
602.0±113.1c
204.0±33.9b
216.0±53.3bc
333.7±24.8d
241.5±59.5a
202.5±9.0bc
21d
855.3±69.8ab
3250.5±317.0b
412.5±51.7b
226.8±24.5bc
243.0±4.2bc
336.0±21.4d
262.5±62.8a
187.5±9.0b
28d
4004.0±274.2c
4488.0±121.0c
634.0±139.5c
266.0±24.2c
305.3±58.7c
342.3±21.1d
357.0±38.7b
214.0±24.2c
35d
4455.0±353.3d
6349.8±488.8d
220.0±28.4a
282.0±14.7c
175.5±42.8b
360.0±28.1d
182.5±50.4a
208.5±13.3bc
42d
5777.8±312.6e
9798.3±710.2e
402.0±77.9b
169.5±46.1ab
238.5±38.1bc
202.5±23.2b
184.5±49.6a
201.0±17.3bc
幼狐脂肪酶的活性随着日龄的增加不同部位呈现出不同的变化规律,不同物种之间胰腺酶活高于肠道脂肪酶活性。
蓝狐和银狐呈现出不同的变化规律。
其中蓝狐胰腺脂肪酶活性随着日龄的增加而增加,1-21日龄增长缓慢,21日龄之后显著增加(P<0.05)。
十二指肠脂肪酶的活性随着日龄的增加呈现不规律性变化,总体要较空肠和回肠脂肪酶活性高。
空肠脂肪酶活性在1-28日龄随着日龄的增加而逐渐增加,35日龄时较28日龄小(P<0.05),随后基本稳定。
回肠脂肪酶活性随着日龄的增加先增加后减小,28日龄时显著高于其它日龄(P<0.05),其它日龄之间差异不显著。
银狐胰腺脂肪酶活性随着日龄的增加而增加,42日龄增加到最大,为9798.3U/ml。
银狐各肠段脂肪酶活性随着日龄的增加先增加后减少。
其中十二指肠1-35日龄逐渐增加,35日龄时活性最高,为282.0U/ml,42日龄显著降低(P<0.05)。
空肠脂肪酶1-14日龄显著增加(P<0.05),14-35日龄变化平缓,42日龄显著降低(P<0.05)。
回肠脂肪酶活性1-14日龄逐渐增加,21日龄之后变化趋于平缓。
2.4幼狐不同日龄小肠内容物乳糖酶活性变化
日
龄
十二指肠
空肠
回肠
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
1514533±60747e
919075±74063a
746783±40989b
1332459±111554b
385211±10489a
480465±56565a
7d
1546600±75556e
1852485±187370c
1592542±79224e
2390857±55216d
890158±86336d
866901±57928b
14d
1254608±143199d
2046849±172625d
1709400±66222e
3258905±103550e
765592±35850c
808419±66614b
21d
1020275±53584c
1943647±77874cd
1258617±99008d
3106968±160607e
711633±54257c
529773±90543a
28d
1052958±46632c
1455537±72861c
1083483±46221c
2382066±187446d
922533±82357d
1740682±95857e
35d
455717±40161b
1196002±17814b
834144±41903b
1917273±159996c
541022±78337b
1496436±79324d
42d
249750±10294a
1019029±58933a
595453±158217a
1031260±71107a
411008±28614a
1202309±111983c
幼狐小肠内容物各个部位乳糖酶活性变化随着日龄的增加呈现出先增加后减小的趋势。
各个部位之间也存在不同,相同日龄的仔狐空肠乳糖酶的活性要较其它部位高。
蓝狐十二指肠乳糖酶随着日龄的增加而逐渐减小,42日龄时最小。
空肠乳糖酶活性1-14日龄显著增加(P<0.05),14日龄之后随着日龄的增加乳糖酶活性显著降低(P<0.05),在42日龄时最小。
回肠乳糖酶活性随着日龄的增加先增加后减小。
银狐十二指肠和空肠乳糖酶随着日龄的增加先增加后减小,均是在14日龄时活性最大。
7日龄回肠乳糖酶显著高于1日龄(P<0.05),随后缓慢降低,28日龄显著高于21日龄(P<0.05),随后又逐渐降低。
2.5幼狐不同日龄小肠内容物麦芽糖酶活性变化
日
龄
十二指肠
空肠
回肠
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
816446±40292b
1222949±116916a
35548±30812a
632975±42701a
190925±35449a
384143±25227a
7d
1881152±155358d
2832335±146717d
1148414
±86692c
2466539±172340c
787206±45537b
1568678±111145c
14d
2794494±146902f
3082314±154981e
1458595±147777d
3033580±105302d
861741±50398b
1631173±151657c
21d
2268735±110565e
2442459±38421c
1769349±
170479e
2897696±108033d
1115160±39340c
1154148±101953b
28d
1411581±99342c
2830041±46551d
1950145±237477e
2641983±187428c
1512490±128546d
2679442±200777d
35d
1317552±196086c
2263001±48915b
1931033±139464e
2548719±31306c
3444096±145124f
2828895±149856de
42d
555573±62341a
2148140±122140b
563027±64934b
2173368±71587b
1774509±352204e
3024406±199647e
幼狐小肠内容物各个部位麦芽糖酶活性变化随着日龄的增加呈现出先增加后减小的趋势。
蓝狐十二指肠各肠段麦芽糖酶活性呈现先增加后减小的趋势,其中十二指肠麦芽糖酶活性在14日龄时最大,空肠和回肠均是在35日龄时麦芽糖酶活性最大。
银狐十二指肠和空肠麦芽糖酶活性1-14日龄显著增加(P<0.05),14日龄之后变化趋于平缓。
而回肠麦芽糖酶活性呈现逐渐增加的趋势,到42日龄时活性最大。
2.6幼狐不同日龄小肠内容物蔗糖酶活性变化
日
龄
十二指肠
空肠
回肠
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
515539±43628b
1917846±209954d
351330±28803a
389303±72145a
380926±29779a
287247±7100a
7d
692159±170464c
2627076±182402e
676353±53544c
652469±54545b
354194±35435a
1090506±156068de
14d
877901±18549d
2558275±180159e
890631±66879d
1236136±102820d
405748±35799a
1291178±188681f
21d
855413±75243d
2687278±165223e
894237±68946d
942009±113662c
409885±18211a
1271684±71070ef
28d
555636±63566b
1517459±245899c
1233475±45005e
1006798±169711a
726210±70695b
451798±91362d
35d
471623±47247b
1232123±162085b
955020±101932d
774401±74714b
1351221±70588c
770579±50315c
42d
239948±19403a
579463±58665a
504719±54390b
829442±63653b
695023±52966b
482185±33254b
幼狐不同日龄各肠段蔗糖酶变化规律呈现先增加后减小的变化趋势,不同物种之间变化规律相同。
蓝狐不同肠段蔗糖酶的活性先增加后减小,其中十二指肠在14日龄时达到最大值,空肠在28日龄时达到最大值,而回肠到35日龄时达到最大值。
银狐十二指肠和回肠蔗糖酶活性、先增加后减小,其中十二指肠在21日龄时达到最大值,空肠在14日龄是达到最大值。
而回肠蔗糖酶活性先增大后减小再增大,在14日龄时达到最大值。
2.7幼狐不同日龄胃蛋白酶活性变化
日
龄
胃粘膜
胃内容物
蓝狐
银狐
蓝狐
银狐
1d
237.72±98.48a
85.56±23.70a
50.11±5.19a
20.89±5.39ab
7d
287.22±32.09a
150.74±20.79b
66.00±3.45ab
25.34±1.89ab
14d
332.44±28.16a
90.45±8.47a
62.34±12.10bc
15.56±2.78a
21d
232.84±40.18a
176.00±15.46b
67.23±19.01a
39.34±0.94b
28d
363.00±16.52b
391.93±18.02c
144.23±10.37e
96.00±18.85c
35d
472.39±31.77b
426.56±31.21c
131.00±30.16de
143.33±10.97d
42d
429.41±22.71b
473.41±18.02d
121.67±3.33d
150.34±14.82d
由表中数据可得,胃黏膜的胃蛋白酶活性要较胃内容物高。
两个物种之间比较发现,胃粘膜胃蛋白酶活性随着日龄的增加先增加后减小在增加,而胃内容物胃蛋白酶活性呈现逐渐增加的趋势。
蓝狐胃粘膜胃蛋白酶活性1-14日龄显著增加(P<0.05),随后减小,21日龄之后在增加,到35日龄时达到最大,为472.3
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