术中输血对荷瘤大鼠肿瘤细胞生长的影响.docx

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术中输血对荷瘤大鼠肿瘤细胞生长的影响

术中输血对荷瘤大鼠肿瘤细胞生长的影响

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

贾文焯　孙建华　黄美雄　许小东　刘玉村

【摘要】目的：

通过建立荷瘤大鼠术中输血模型，探讨肿瘤患者围手术期临床输血对机体免疫机能的影响。

方法：

对接种Wolker256肉瘤细胞的雌性Wistar大鼠行剖腹手术，随机分成6组，分别行同种异系不同成分输血及同种同系输血，其中以输生理盐水组为阴性对照组。

术后测量肿瘤体积和采用流式细胞术测定外周血T细胞亚群的变化，了解机体细胞免疫功能的变化情况。

结果：

术中输入同种异系大鼠全血及白细胞组大鼠的肿瘤生长速度明显快于对照组，其细胞免疫功能明显较对照组受到抑制（P0.01）；而术中输入同种同系大鼠全血和同种异系大鼠红细胞、血浆组的肿瘤细胞生长速度及细胞免疫功能与对照组比较差异均无统计学意义（P0.05）。

结论：

同种异系血中白细胞成分促进肿瘤细胞生长，而血浆和红细胞则影响不大。

【关键词】同种异体输血·肿瘤细胞·大鼠，Wistar

【ABSTRACT】Objective：

Tostudytheeffectsofperioperativetransfusionontheimmunityoftumorpatientsbyestablishingtheexperimentaltumor-borneratmodelswithIntraoperativetransfusion.Methods：

ExperimentalfemaleWistarratsinoculatedwithWolker256sarcomacellsweredividedintosixgroupsrandomlywhoreceivingdifferenttransfusionsduringlaparotomy.TumormasswasmeasuredandthechangesofTsubsetswasanalyzedbyflowcytometrypostoperatively.Results：

TherattransfusedwithwholebloodandleucocytefractionofSDrathadanobviouslyrapidtumorgrowthanddepressedcell-mediatedimmunity（P0.01）;whiletheothergroups（transfusedwithwholebloodofWistarrat，serumanderythrocytefractionofSDrat）hadnosignificantdifferencefromthecontrolgroup（P0.05）.Conclusion：

Thecomponentsofallogeneicleucocytepromotethetumorcellgrowth;whiletheserumanderythrocytehavenoeffect.

【KEYWORDS】Allogeneicbloodtransfusion·Tumorcells·Rats,Wistar

　　输血是临床常用的治疗措施，多种肿瘤患者术中输血后肿瘤复发率明显增高。

然而肿瘤患者手术过程中输血往往难以避免，如何达到既保证手术成功又可避免输血引起的术后肿瘤复发率增高，是目前亟待解决的问题。

近年来，大量研究发现输血对机体免疫功能有一定的抑制作用，这种免疫抑制在输血造成的肿瘤复发率升高中可能起了主要作用［1-3］。

本研究旨在通过建立荷瘤大鼠术中输血模型，测定输注各血液成分对大鼠肿瘤生长的影响及大鼠外周血T细胞亚群免疫功能的变化情况，来进一步探讨患者术中输血的安全性问题及其对策。

1　材料与方法

1.1　实验动物及分组　雌性Wistar大鼠40只，6～8周龄，体质量（150±6.3）g。

其中30只分成6组，每组5只，分别输注同种异系（SD大鼠）全血、血浆、白细胞、红细胞悬液，同种同系（Wistar大鼠）全血及生理盐水（阴性对照组），构建输血模型；其余10只中有5只供Wolker256肉瘤细胞株传代之用，另5只作为同种同系供血动物。

另以10只SD大鼠作为同种异系供血动物。

1.2　血液制备　首先将5只SD大鼠依次剖腹，下腔静脉取血6～8mL，置于肝素抗凝管中摇匀并离心，上层为血浆层，中间为白细胞层，下层为红细胞层，分层吸取，用生理盐水配制成每毫升含有相当于1mL全血的血浆、白细胞、红细胞悬液；然后将5只Wistar大鼠及另外5只SD大鼠剖腹后抽取全血备用（肝素抗凝）。

1.3　输血模型的建立　Wolker256肉瘤细胞株经孵化，行大鼠腹腔接种，平均7ｄ传代1次。

取腹水行颈后皮下注射，5～7d生长出肉瘤，建立荷瘤大鼠模型。

实验组大鼠于手术当天行皮下接种Wolker256肉瘤细胞。

戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉时间（25±5）min。

将大鼠四肢固定剃除术区毛发，取尾静脉血0.5mL，置于肝素抗凝管中摇匀。

术野消毒铺巾后开腹，充分显露下腔静脉，将TB针折弯后沿静脉走行方向穿刺进入，推动注射器行穿刺输血。

首先取3组实验动物，经下腔静脉分别输入生理盐水（对照组）、Wistar大鼠全血（Wistar全血组）及SD大鼠全血（SD全血组）各2mL；再取3组实验动物，分别输入SD大鼠血浆（SD血浆组）、红细胞（SD红细胞组）和白细胞（SD白细胞组）各2mL。

缓缓退出针头，穿刺点压迫止血后逐层连续缝合切口，完成模型建立。

1.4　测量肿瘤体积　肿瘤皮下接种后5～15ｄ测量肿瘤的长、短径，肿瘤体积按下列公式计算：

V=a×b2×π/6（a为长径，b为短径）

1.5　荷瘤大鼠输血前后细胞免疫功能变化的测定　采用流式细胞仪（FCM，美国BD公司生产）自动细胞记数法测定。

测定过程：

分别制备术前、术后3d、术后7d大鼠肝素抗凝全血0.5mL；分别向两只试管中加入CD3/CD4、CD3/CD8抗体20μL（荧光素标记的单抗，美国BD公司生产）；再向各试管中加入100μL已经制备好的抗凝血，低速混匀3min，室温避光静置20min；样本与单抗孵育完毕后，每管加100μL溶血素，震荡混匀，室温避光静置10min；接着每管加1mL双蒸水，震荡混匀；放置待血液透明后立即离心，离心力300g×5min，吸去上清液，留50μL液体于试管中；低速混匀，重悬细胞，每管中加入2mL含0.1%叠氮钠的PBS，低速混匀；离心5min，离心力200g×5min，吸去上清液，留50μl液体于试管中；每管中加入500μL的1%多聚甲醛PBS固定细胞，低速混匀，将处理好的样本于2～8℃避光保存待测。

设置和调节仪器后，用CellQuest软件来获取和分析样本，获取足够多的细胞数以保证淋巴细胞门中至少有4000个淋巴细胞。

1.6　统计学处理　应用SPSS10.0统计软件包，对测定结果进行成组设计的t检验，P≤0.05为差异有统计学意义，P0.01为有显著意义。

2　结果

2.1　不同时间肿瘤大小的测定　在本研究条件下，肿瘤细胞接种后5d可触及实体肿瘤。

前3组实验大鼠中，SD全血组肿瘤细胞生长速度较对照组明显增快（P＜0.01）；而Wistar全血组肿瘤细胞生长速度与对照组差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

后3组实验大鼠中，SD白细胞组肿瘤生长速度与SD全血组一致，较对照组明显增快（P0.01）；而SD血浆组及SD红细胞组肿瘤生长速度与对照组差异无统计学意义（P0.05，见表1）。

2.2　不同时间大鼠免疫功能测定　在本研究条件下，术前各组动物细胞免疫水平基本相同；术后3、7dSD全血组及SD白细胞组的大鼠细胞免疫功能较对照组明显受到抑制（P0.01）；而其他组免疫功能与对照组之间差异无统计学意义（P0.05，表2）。

3　讨论

　　输血是临床常用的一种有效治疗措施，但输血往往对受血者的免疫系统造成一定的影响。

主要表现为抑制效应，对肿瘤患者的预后不利。

如何达到既保证手术成功又可避免因输血引起的术后肿瘤复发率上升是人们所关注的。

　　1973年Opelz等［4］回顾性研究显示有输血史的患者其肾移植的存活率增加20%，且受血5次者更为明显。

Burrows等［３］在1982年首次报道了结直肠癌患者输血后肿瘤复发率升高且5年生存率明显降低，自此人们在其他肿瘤如乳腺癌、肺癌、宫颈癌、软组织肉瘤患者中均发现类似情况。

研究发现输血对各期肿瘤术后复发均有促进作用，其对肿瘤复发率及5年生存率的影响与手术方式、术中出血量及输血量无明显相关性［５-７］。

Taniguchi等［８］研究认为同种异体输血与肿瘤转移率及患者的生存率密切相关。

　　输血对受血者的特异性、非特异性免疫均有明显的抑制作用，推测输血引发的免疫学改变包括以下几点［９］：

1）混合淋巴细胞反应降低和体外混合淋巴细胞反应的抗特异性抗体产量增高；2）单核/巨噬细胞数量及活力降低，NK细胞数量及活力降低；3）降低细胞毒性T细胞活性；4）产生血清抑制因子；5）增加抑制性T细胞、抑制性单核细胞活性；6）产生对抗T细胞抗原特异受体的抗基因抗体。

输血引起免疫应答的抑制，可能造成机体形成有利于肿瘤细胞生长的生物环境。

　　本研究通过动物实验对文献中提出的可能机制进行了初步验证。

首先建立荷瘤大鼠模型，然后对大鼠进行分组输血，其中输入同种异系全血、同种异系白细胞悬液的大鼠肿瘤生长明显较对照组快（P0.01）；而输入同种同系血、同种异系的血浆及红细胞的大鼠与对照组之间肿瘤生长差异无统计学意义（P0.05）。

同时对术前及术后3、7d外周血T细胞亚群的变化进行了流式细胞术分析，发现输入同种异系全血、同种异系白细胞悬液的大鼠T细胞功能较对照组明显受到抑制（P0.01）；而输入同种同系全血组、同种异系血浆组及红细胞组与对照组之间比较差异无统计学意义（P0.05）。

提示肿瘤患者采用自体输血或红细胞成分输血可能会减少因输血而引起术后复发的机会。

　　Blajchman等［１０］进行的一项前瞻性研究发现输血的结直肠癌患者5年生存率为57%，而未输血的为77%，且发现结直肠癌患者19年后输血组的外周淋巴细胞、T细胞、Th和Ts水平比非输血组低，结直肠癌术后近期输血CD2、CD3和CD4均低于对照组。

进一步的研究认为同种血浆、同种白细胞及在储血中沉积的某些血液成分与输血相关的免疫抑制有关［１１］。

具有相同H-2系统的鼠之间输血未发现促进移植肿瘤生长的效应；具有不同H-2系统的鼠则有显著效应。

5项RCT研究认为同种输血对肿瘤复发或术后感染的效应是由白细胞介导的。

　　大量的研究提示输血对肿瘤患者术后复发有促进作用［１，３］。

但肿瘤患者手术前后输血往往是不可避免的，外科医师所能作到的是尽可能的减少不必要的输血。

然而患者是否需要输血没有一个明确的标准。

美国麻醉医师协会最新输血指南建议血红蛋白（hemoglobin,Hb）＜60g/L的急性贫血应输入红细胞；Hb＞100g/L通常无须输红细胞；Hb为60～100g/L应根据是否存在进行性器官缺血、进行性出血致血管内容量不足和氧合不佳等危险因素决定［１２］。

临床上确实需要输血的肿瘤患者，采用红细胞成分输血可能会减少术后复发率。

最近的研究提示血液中引起免疫机能障碍的成分主要存在于白细胞及白细胞分解产物之中，其中白细胞ClassⅡ主要组织相容性复合体抗原及白细胞抗原可能担任了主要角色［１３］。

与本研究结论一致。

因而红细胞成分输血仍是相对较好的方法