PCR过程与方法.docx
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PCR过程与方法.docx
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PCR过程与方法
.2主要试剂及仪器
RNA提取试剂盒(Trizol)购自MBI公司;反转录试剂盒购自Fermentas公司;PCR反应的试剂购自宝生物工程(大连)公司;DEPC(焦碳酸二乙酯)购自SIGMA公司;SYBRGreen荧光定量试剂盒购自Toyobo公司;八联管购自Axygen公司;氯仿,异丙醇,无水乙醇等常规试剂购自上海生工生物工程有限公司。
引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。
GE公司IQ300凝胶成像系统、ND-1000浓度测定仪、ABI7500荧光定量PCR仪。
1.3试剂配制
所有试剂配制同第二章。
2试验方法
2.1引物合成
选取Beta-actin基因作为内参基因[54],根据GenBank中公布的鸡Pax-3、Pax-7基因的mRNA序列各设计1对引物。
引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。
各引物的信息以及反应条件见表4-1。
表4-1荧光定量PCR引物
Table4-1PrimersusedforRQ-PCR
引物编号
Number
序列
Sequences
片段长度
Size
退火温度
Anealingtemperature
Beta-actin
F:
5’GAGAAATTGTGCGTGACATCA3’
152bp
60℃
R:
5’CCTGAACCTCTCATTGCCA3’
Pax-3
F:
5’CTCGGGAAGAACTCGCACAA3’
150bp
58℃
R:
5’ATGGAGGTGGGCTGATAGGATG3’
Pax-7
F:
5’CTGTCACCACCTCTTTGC3’
142bp
60℃
R:
5’TGGAAGCGGGTCACATA3’
2.2胸肌、腿肌总RNA的提取
2.2.1提取RNA前的准备工作
(1)玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜,用自来水反复冲洗,再用超纯水冲洗2遍,180℃烘烤6h;
(2)匀浆器、电泳槽等用0.1%的DEPC水冲洗浸泡,由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响,可用0.5%的SDS处理;
(3)Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌使DEPC失活。
2.2.2Trizol一步法提取组织总RNA
按照Trizol试剂盒说明书操作。
(1)取50-100mg组织样(-70℃超低温冰箱中保存)放入研钵,加液氮迅速研磨成粉,转至匀浆器内,加入1mLTrizol,冰浴中快速匀浆后转至1.5mL的离心管中,冰上静置5min;
(2)加入0.2mL氯仿,用手剧烈摇15秒混匀,15-30℃孵育2-3min后,于4℃12000rpm离心15分钟,取上层水相于一新的离心管中,加入0.5mL异丙醇,混匀后15-30℃静置10min;
(3)12000rpm离心10分钟,弃上清,沉淀用现配的75%乙醇洗涤,4℃7500rpm离心5min;
(4)弃上清,室温干燥沉淀,干燥后加入30-60µL的去离子甲酰胺以溶解RNA,-70℃保存。
2.2.3RNA检测
(1)RNA的分光光度计检测
ND-1000测定提取的总RNA在260nm和280nm下测吸光度A值,并计算OD260/OD280的值以确认RNA的质量和产量。
此值在1.7-2.1之间说明提取的RNA纯度较高,适宜进行下一步的实验(根据样品在260nm波长处的吸光度值确定总RNA提取液中RNA的浓度,以便在反转录的过程中进行定量:
1个单位OD260值单链RNA=40µg/mL);若低于1.7,则说明提取的RNA中可能有蛋白质的污染,可用酚:
氯仿抽提去除。
(2)RNA的电泳检测
电泳槽用RNA清洗液浸泡4-5h,再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。
琼脂糖凝胶用1×TBE配制。
在5µL上样缓冲液中加入5µL组织总RNA。
65℃变性10min后立即放入冰水中2-3min,点样于琼脂糖凝胶中5V/cm电泳,电泳待溴酚蓝至胶2/3处,取下凝胶,GoldView染色,凝胶成像系统检测电泳结果。
2.3反转录
根据各样品总RNA的浓度,对各个个体的总RNA进行稀释,使最终浓度为100ng/µL。
反转录体系为20µL:
在一0.2mL的PCR管中加入0.2µg总RNA,oligo(dT)18引物0.2µg,加DEPC处理水至总体积35µL,4℃8000rpm瞬时离心后,在PCR仪内70℃孵育5分钟,迅速置于冰上冷却,加5×ReactionBuffer(250mMTris-HCl(pH8.3),250mMKCl,20mMMgCl2,50mMDTT)10µL,10mMdNTPMix(dATP,dCTP,dGTPanddTTP各10mM)2µL,RiboLockTMRibonucleaseinhibitor(20U/µL)2µL,瞬时离心后,PCR仪内37℃孵育5分钟后加入RevrtAidTMM-MµLVReverseTranscriptase(200U/µL)1µL(以上步骤均为冰上操作)。
瞬时离心后置于PCR仪内42℃孵育60min,最后70℃10min终止反应,所得产物即为cDNA,置于-20℃保存备用。
2.4目的片段的PCR扩增
采用定量引物进行常规PCR,扩增体系20µL:
cDNA2.0µL
10×PCR扩增缓冲液2.0µL
dNTPs1.5µL
(dATP,dCTP,dGTPanddTTP各10mM)
上游引物(10mM)1.0µL
下游引物(10mM)1.0µL
Taq酶0.2µL
加RnaseFree水至总体积为20µL
以上步骤均为冰上操作。
将上述试剂加入一0.2mLPCR管,瞬时离心,将PCR管置于PCR仪上,按以下条件反应:
94℃热变性5min,然后94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸30s,40个循环,最后72℃延伸10min;10℃保温。
反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。
2.5扩增片段的回收和克隆测序
上述PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,用TakaraAgaroseGelDNAPurificationKit回收目的产物。
回收目的片段后连接到T-载体上,转化到DH5α中进行克隆,保种后送上海生工生物工程有限公司测序。
2.6重组质粒的提取
采用Axygen公司Plasmidminiprepkit进行重组质粒的提取,按照试剂盒操作说明进行:
(1)取保种的菌液,接种到含有7-8mL培养基的试管中;
(2)37℃摇床培养10-12小时后取出200µL菌液保种,其余的用来提取质粒DNA;
(3)保种后的剩余菌液,12000rpm离心3min收集细菌;
(4)加250µLBufferS1悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块;
(5)加250µLBufferS2,温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液,此步骤不宜超过5分钟;
(6)加300µLBufferS3,温和并充分地上下翻转混合6-8次,12000rpm离心10分钟,取上清;
(7)小心吸取上清于制备管(置于2mL离心管内)中,12000rpm离心1分钟,弃滤液;
(8)将制备管置回离心管中,加入500µLBufferW1,12000rpm离心1分钟,弃滤液;
(9)将制备管置回离心管中,加入700µLBufferW2,12000rpm离心1分钟,弃滤液;重复该步骤一次;
(10)将制备管置回离心管中,12000rpm离心1分钟;
(11)将制备管移入新的1.5mL离心管内,在制备管膜中央加入60µL左右的Eluent或去离子水,室温静置1分钟,12000rpm离心1分钟;溶解后-20℃保存;
提取的质粒进行PCR和测序鉴定后,采用ND-1000测定其浓度和纯度,10倍系列稀释用于荧光定量PCR。
2.7实时荧光定量PCR
采用SYBRGreenⅠ染料法,优化荧光定量PCR的反应条件,确定反应体系(20µL):
SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix10µL
上游引物(10mM)0.8µL
下游引物(10mM)0.8µL
cDNA2.0µL
加RnaseFree水至总体积为20µL
以上步骤均为冰上操作。
每个样品设3个重复值,设阴性对照。
PCR扩增程序为:
95℃热变性1min,然后95℃变性15s,60℃复性15s,60℃延伸34s(datacollection),40个循环;为分析扩增的特异性,PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析,程序为:
95℃,60℃1min;95℃,60℃15s。
2.8统计分析
2.8.1荧光定量计算方法
采用
方法PCR扩增指数的等式为:
式中:
是PCR经过n个循环后目的基因的分子数;
是目的基因的起始分子数;
是PCR扩增效率;n为循环数。
是目的基因达到阈值时所经历的循环数,因此:
,其中,
是达到阈值时目的基因的分子数,
是目的基因达到阈值时的循环数,
是常数。
同样,对于内参基因,其等式为:
,
是达到阈值时内参基因的分子数,
是内参基因的起始分子数,
是内参基因的扩增效率,
是内参基因达到阈值时的循环数,
是常数。
基因表达量为:
,假定目的基因和内参基因的扩增效率,
,则:
或
,其中
相当于校正了的目的基因数量(
),
是目的基因与内参基因的
之差(
),重排后得到:
,最后用样品q来作为比较的标准,则:
,
,则目的基因的相对表达量为:
,
样品与对照品间差异表达的倍数。
当扩增效率不一致时,采用下列公式进行计算:
在本试验中,荧光定量PCR仪根据试验的Ct值,按照上述公式原理,直接得出RQ值的柱形图。
2.8.2引物扩增效率的计算
根据PCR反应的通式
,两边取对数得到:
,则循环数
,由于对于一特定的PCR而言,扩增效率
和最终目的基因的产物量
为常数,那么上式即是循环数对原始拷贝数对数的方程,其简化形式为:
,该直线的斜率为
,横坐标上的截距为
,即是荧光定量所谓的标准曲线。
根据
,斜率的计算等式为:
。
3结果与分析
图4-11.5%琼脂糖检测荧光定量PCR引物的扩增效果
Table4-1AgaroseelectropHoresisresultsofPCRforRQprimers
3.1常规PCR及测序
常规PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图4-1。
各基因PCR扩增产物条带清晰、明亮,无杂带,说明产物具有很高的特异性。
测序结果与目的序列一致性100%,为目的基因片段。
3.2目的基因与内参基因的标准曲线及溶解曲线
将插入目的片段的质粒进行10倍梯度稀释,以稀释的质粒为模板构建目的基因和内参基因的标准曲线。
内参基因Beta-actin的标准曲线为:
Y=-3.218X-3.2646,R2=0.983,E=103%,扩增效率E=93%;Pax-3基因的标准曲线为:
Y=-3.32X+12.2835,拟合度R2=0.995;Pax-7基因的标准曲线为:
Y=-3.34X-0.0848,R2=0.991,E=110%。
其中Y为Ct值,X为初始模板量的对数,所有标准曲线的拟合度达到了0.98以上,扩增效率在理想的90-110%范围内,实验重复性较好。
内参基因、目的基因的标准曲线、溶解曲线图见图4-2、4-3、4-4。
图4-2Beta-actin基因的标准曲线及溶解曲线;
Fig.4-2StandardcurvechartsandmeltcurvepeakchartsofBeta-actingene
图4-3Pax-3基因的标准曲线及溶解曲线
Fig.4-3StandardcurvechartsandmeltcurvepeakchartsofPax-3gene
图4-4Pax-7基因的标准曲线及溶解曲线
Fig.4-4StandardcurvechartsandmeltcurvepeakchartsofPax-7gene
3.3如皋黄鸡Pax-3基因不同发育阶段的表达规律
如皋黄鸡胸肌内Pax-3基因的相对表达量见表4-2。
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