沙门氏菌X4062染色体质粒平衡致死系统的构建毕业论文.docx
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沙门氏菌X4062染色体质粒平衡致死系统的构建毕业论文
本科毕业论文
沙门氏菌X4062染色体-质粒平衡致死系统的构建
毕业设计(论文)原创性声明和使用授权说明
原创性声明
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所呈交的毕业设计(论文),是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。
尽我所知,除文中特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果,也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。
对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体,均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
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作者签名:
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摘要
鉴于临床多种耐药性菌株不断产生和迅速水平传播扩散,FDA(FoodandDrμgAdministration食品与药物管理机构)已禁止在重组菌生产中使用抗生素和含抗药性基因作为筛选标志的载体质粒。
染色体-质粒平衡致死系统是近年来发展起来的一类以非抗生素作为筛选标记的载体表达系统,它的宿主菌通常是一类染色体管家基因的突变体,该缺陷型菌株不能在基本培养基上生长,当导入带有其完整基因的互补质粒后,质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式构成染色体-质粒平衡致死系统,此时互补质粒对其宿主菌的生长起到功能性互补的作用,一旦质粒丢失,细菌则由于不能合成必需物质而死亡。
基于减毒沙门氏菌染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建沙门氏菌X4062的asd基因缺失突变株X4062△asd:
:
cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶基因的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。
结合PCR扩增和测序结果,证明沙门氏菌X4062Δasd缺失突变株的正确构建。
另外,从沙门氏菌X4062基因组中扩增出asd基因片段,将该片段整合到带有表达荧光蛋白基因的质粒pEGFP中,命名为pMD-asd。
缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入含有asd基因的质粒(pMD-asd)才能在LB培养基上生长,与原型沙门氏菌X4062比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致,基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统。
关键词:
FDA沙门氏菌受体菌Red重组系统asd基因
缩略语及英汉对照
Amp
ampicilin
氨苄青霉素
Cm
chloroamphenicol
氯霉素
FDA
FoodandDrμgAdministration
食品和药物管理局
DAP
diaminopimelicacid
二氨基庚二酸
asd
aspartatesemialdehydedehydrogenase
asd基因
ddH2O
doubledistilledwater
双蒸水
dNTPs
deoxyribonucleosidetriphosphate
三磷酸脱氧核糖核苷
LB
Luria-Bertani
细菌基础培养基
h
hour
小时
min
minutes
分钟
mL
milliliter
毫升
mmol
millimolar
毫摩尔
mol
molar
摩尔
PCR
polymerasechainreaction
聚合酶链式反应
rpm
roundperminute
每分钟转数
s
seconds
秒
RNA
ribonucleicacid
核糖核酸
μL
microlitre
微升
μmol
micromolar
微摩尔
StructureofSalmonellaX4062Chromosome-plasmidBalancetoDeathSystem
LiuYongwei
(CollegeofLifeScience,SouthChinaAgricμLturalUniversity,Guangzhou510642,China)
Abstract:
Inviewofavarietyof resistantstrainsofclinical continuouslyproducingandquicklyspreading,theFDA(FoodandDrμgAdministration)hasbannedrecombinantstrainsusedinproductionandcontainantibioticsresistancegenesasthecarrierofscreeningmarkplasmid.
Chromosome-plasmidbalancetodeathsystemisdevelopedinrecentyearstoclasswiththeantibioticselectionmarkersasthecarrierofexpressionsystem.Itusuallyisakindofhostbacteriumchromosomestewardofthemutantgene.Thedefectstypestrainscan'tgrowinbasicmediumandwhilethecomplementaryplasmidwithcompletegeneticisimportedinit,theplasmidandthedefecttypestrainswillstructureachromosome-plasmidbalancetodeathsystemasgeneticcomplementary.Atthistime,thecomplementaryplasmidplaysafunctionalcomplementaryrolewhichhostthegrowthofthehostbacterium.Oncetheplasmidlost,thehostbacteriumwoμLdn’tbeabletosynthesisnecessarymaterialanddeath.
Basedontheknownsequencesofthegeneasd onthechromosomeofreductionpoisonsalmonella,structurethesalmonellaX4062’smutationwithoutgeneasd,X4062△asd:
:
cat.Inthesecondrestructuring,maketheplasmidpCP20carryingthegenewhichcanexpressFLPsitespecificityrestructuringenzymeuseofmediatingthesecondhomologousrestructuringtoremovetheChloramphenicolresistancescreeninggeneofthelackmutationintheabove.CombinedwiththeresμLtofPCRamplificationandsequencing,provethatthesalmonellaX4062’slackmutationisstructuredcorrectly.Moreover,copythegeneasdfragmentfromthegenomeofsalmonellaX4062andcombineitintheplasmidpEGFPwiththegeneexpressfluorescentprotein,namedpMD-asd.thelackmutationslostaren’tabletogrowintheordinaryLBmediumuntiladdingDAPorimportingtheplasmidwithgeneasd(pMD-asd).
ComparedwithsalmonellaX4062prototype,theirgrowthspeed,growthlogarithmperiodandthetransformationefficiencyofacceptingtheplasmidindifferentnumberofcopiesarenearlyconsistent.Basedonthelackmutationsconstructthesalmonellachromosome-plasmidbalancetodeathsystemwithasdnutritiongeneassign.
Keywords:
FDASalmonellaReceptorbacteriaRedreorganizationsystemGene
目录
1前言1
1.1减毒沙门氏菌载体系统的研究进展1
1.1.1减毒细菌活载体疫苗1
1.1.2减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用1
1.1.3减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制2
1.1.4沙门氏菌的减毒2
1.2研究意义与目的6
1.3研究内容6
1.4技术路线6
2材料与方法7
2.1实验材料、试剂和仪器7
2.1.1毒株、细胞、菌株及质粒7
2.1.3培养基、试剂的配制7
2.1.4仪器和器材9
2.2方法9
2.2.减毒鼠伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建9
2.2.1菌株与质粒9
2.2.2引物设计10
2.2.3asd基因的制备10
2.2.4含FRT位点和cat基因的同源重组片段的制备和纯化11
2.2.5沙门氏菌电转感受态细胞的制备12
2.2.6重组酶质粒pKD46的转化和诱导表达12
2.2.7asd基因的敲除13
2.2.8沙门氏菌△asd:
:
cat的鉴定13
2.2.9氯霉素抗性基因的去除13
2.3含EGFP的双启动子互补表达载体pCLA-EGFP的构建14
2.3.1表达载体pCLA-EGFP的构建策略14
2.3.2载体构建所用引物14
2.3.3重组质粒pCLA-EGFP的构建16
2.3.4pCLA-EGFP质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4062(Δasd)中的表达19
2.3.5pCLA-EGFP质粒在X4062(Δasd)中的体外遗传稳定性实验19
3结果与分析19
3.1减毒鼠伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建19
3.1.1asd基因的制备19
3.1.2含FRT位点和cat基因的同源重组片段的制备20
3.1.3同源重组菌(△asd:
:
cat)的PCR鉴定21
3.1.4重组菌沙门氏菌△asd的鉴定22
3.2重组质粒pCLA-EGFP的构建及鉴定23
3.2.1pCL-EGFP片段的扩增23
3.2.2asd基因的扩增23
3.2.3重组质粒pCLA-EGFP的鉴定24
3.3重组质粒pCLA-EGFP在鼠伤寒沙门氏菌X4062Δasd中的表达24
3.4pCLA-EGFP质粒在X4062(Δasd)中的体外遗传稳定性25
3.5重组菌X4062Δasd(pCLA-EGFP)表达产物的SDS-PAGE分析25
4讨论26
参考文献28
致谢32
附录33
华南农业大学本科专业毕业论文成绩评定表34
1前言
1.1减毒沙门氏菌载体系统的研究进展
1.1.1减毒细菌活载体疫苗
载体疫苗是将所需的编码病原特异性抗原的DNA片段插入减毒的活细菌或病毒载体,以提呈表达所编码的抗原,以期达到预防一种或多种疾病的作用。
重组细菌疫苗载体大多数利用共生细菌或者减毒的病原菌作为载体,利用减毒病原菌作为载体,可以同时产生针对异源抗原和载体病原菌的免疫反应。
减毒细菌活载体疫苗因其能够刺激机体产生针对活载体及其携带的外源抗原的体液、细胞免疫和局部粘膜免疫受到人们的广泛关注。
减毒细菌通过口服进入机体,诱导机体产生针对特定抗原的各种免疫应答。
减毒细菌通过突变其某些致病基因,使其毒性降低,由于减毒的微生物仍有一定的感染性,可以模拟天然的疾病发生过程,通过口服,进入肠道相关淋巴组织,因此可以全方位地激活机体免疫系统,从而产生粘膜免疫应答及全身免疫应答(王芳,2002)。
目前一些病原菌,如李斯特菌、沙门氏菌、耶尔森菌、志贺氏菌及分支杆菌己经被广泛用作载体菌携带外源抗原,而一些有益的微生物也成功地被用做载体,如乳酸菌为载体的疫苗,它们可以以食物的形式进入体内,也可以通过阴道途径进行免疫(童光志,2009)。
减毒细菌活载体疫苗的优点:
培养方便,生产成本相对低廉,适用于大范围内的免疫接种;免疫方法简便易行,可以通过口服和鼻腔接种;高效的免疫原性,能够刺激机体的全身免疫;可以携带较大的基因片段,易于构建多价疫苗。
1.1.2减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用
沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人类和动物肠道,内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。
沙门氏菌无芽胞,无荚膜,多数有菌毛,鞭毛。
沙门氏菌是肠杆菌科的重要病原菌属,到2007年为止已发现2579种血清型(PatrickA.D.Grimont,2007)。
沙门氏菌属分为两个种名,分别是Salmonellaenterica和Salmonellabongori,其中Salmonellaenterica又分为六个亚种。
绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性,能引起人和动物的多种不同临床表现的沙门氏菌病。
1892年首次从鼠身上分离出鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium,st),1893年证实该菌可引起食物中毒,明确了该菌可以使人、鼠共同致病。
鼠伤寒沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌,表达外源抗原的减毒沙门氏菌经口服免疫后,能激发机体产生分泌型抗体、体液免疫和细胞免疫(Cardenasetal,1992);(Darjietal,2000),并已应用于细菌(Wangetal,2009)、病毒(Chin'Ombeetal,2009)、寄生虫(Quetal,2008)、肿瘤(Shahabietal,2010)等疫苗的研制。
沙门氏菌还可以成功地把DNA疫苗转移至细胞内(Darjietal,1997)。
野生型沙门氏菌对机体有毒性作用,通过突变沙门氏菌毒力基因的方式构建减毒沙门氏菌菌株,限制其致病性,可以提高沙门氏菌作为基因及其产物传递工具的安全性。
正是这些特性使减毒沙门氏菌成为一种具吸引力的,能够将外源抗原转至哺乳动物免疫系统的表达载体。
1.1.3减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制
沙门氏菌进入体内的途径有两种:
一种是以M细胞为代表的上皮细胞途径,另一种是非上皮细胞途径。
具有侵袭力的沙门氏菌可选择性地侵入派伊尔结(Peyer’spatchs,PPs)的M细胞。
M细胞是1974年Owen在粘膜淋巴结的滤泡相关上皮(Follicleassociatedepithelia,FAE)中发现了一种特殊的扁平上皮细胞,因其表面有微小的皱褶,又称微皱褶细胞(赵燕等,2001)。
沙门氏菌入侵M细胞后被抗原呈递细胞(APC)捕获然后APC再与相关免疫细胞相互作用,从而产生免疫应答或造成机体感染。
沙门氏菌还可通过吞噬细胞直接吞噬的非上皮细胞途径侵入机体。
Vazquez-Torres等发现CD18+吞噬细胞可在肠道直接吞噬沙门菌并将其运送至脾脏(Vazquez-Torresetal,1999)。
Rescigno等发现DCs具有细菌摄取能力,DCs通过打开肠道上皮间的紧密连接,直接进入肠腔吞噬沙门菌(Rescignoetal,2001)。
沙门氏菌被巨噬细胞或者树突状细胞吞噬后,一方面刺激机体产生免疫应答,一方面被转运到到达肠系膜淋巴结和血液并被脾脏和肝脏的巨噬细胞吞噬,在肝脏和脾脏会形成多细胞的感染病灶,从而形成持续感染(Mastroenietal,2009),并持续刺激机体产生免疫应答。
减毒的沙门氏菌,最终会被宿主清除。
1.1.4沙门氏菌的减毒
由于沙门氏菌是人畜共患病原菌,野生型沙门氏菌会引起人和动物肠热症、胃肠炎、败血症等。
因此应用其作为疫苗载体之前需要作减毒处理,减少病原菌对动物宿主的致病性。
同时当其致病性大时,更容易激起身体的免疫反应,导致机体清除病菌,降低疫苗载体在肠道内生存的时间。
减毒株感染宿主细胞后可在体内长期存活并诱导产生保护性免疫反应。
早期减毒手段是利用化学物质诱变和紫外线照射,这两种手段具有很大的盲目性,且由于引起的往往是点突变,因此极易产生回复突变。
随着对沙门氏菌毒力因子和免疫机理的深入了解以及DNA重组技术的发展,在沙门氏菌染色体基因组上随机插入一个转座子或删除、突变一段或几段基因片段的减毒手段已广泛应用(姜娜,2009);(徐引第,2006)。
目前已研制出许多新的、遗传确定的、新型减毒株作为口服活疫苗的候选菌株,包括:
营养缺陷型突变株(aroA、aroCD、purA)(Hoisethetal,1981);(Honeetal,1991);(O'Callaghanetal,1990),热休克蛋白酶缺陷株(htrA)(Johnsonetal,1991),腺苷酸环化酶缺陷株(cya、crp)(Curtissetal,1996);(Curtissetal,1987),毒力调控缺失株(PhoP-Q、Dam、SlyA)(Milleretal,1989);(Heithoffetal,1999);(Kanekoetal,2002);(Milleretal,1990)。
1.1.5染色体-质粒平衡致死系统
染色体-质粒平衡致死系统又叫载体-宿主平衡致死系统,其宿主菌由于管家基因的突变或缺失,导致细菌不能合成必需的营养物质,因而不能在基本培养基上生长,必须在添加相应营养物质后方可生长。
当带有其管家基因的互补质粒导入缺陷型宿主菌后,载体-宿主构成遗传互补,缺陷型宿主菌可在无特殊营养物质添加的基本培养基上生长。
由于宿主菌依赖互补质粒才能生长,一旦质粒丢失,细菌因不能合成必需的物质,不能在基本培养基上生长。
应用营养选择标志,该系统无需使用抗生素标记即可使外源基因在宿主菌中稳定表达。
传统的表达载体通常带有抗药基因,为了使质粒稳定遗传,必须使用抗生素作为选择压力。
但是,按照美国FDA食品与药物管理机构(FoodandDrμgAdministration)的规定,活疫苗中不能存在抗药质粒,且在人和动物体内,无法以抗生素来维持重组质粒的稳定性。
因此,在活载体疫苗中使用染色体-质粒平衡致死系统携带和表达外源基因,更具安全性和稳定性。
应用同源重组技术,科研人员己成功构建了伤寒沙门氏菌属的营养缺陷株,其中以asd基因和thyA基因构建的平衡致死系统得到了广泛使用。
asd基因负责编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶,是细菌的赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、二氨基庚二酸合成途径中的一种关键酶(Galanetal,1990);(Schleiferetal,1972)。
二氨基庚二酸(DAP)是构成革兰氏阴性细菌细胞壁上的肽聚糖的基本成分,缺少DAP将导致细胞的裂解和死亡。
在基本培养基和动物体内无DAP的存在,因此asd基因可用于构建染色体-质粒平衡致死系统。
1988年,Nakavama等建立了以asd基因为选择标志的染色体-质粒平衡致死系统。
Nakavama首先构建了asd基因缺失(△asd)的S.typhimurium菌株,将表达asd基因的质粒转化至asd基因缺失(asd-)鼠伤寒沙门氏菌中,构成互补系统并能高效和稳定的表达外源基因(NakayamaK,1988);(Asconetal,1998)。
ThyA基因编码胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成酶(thymidylatesynthase),该酶是dTMP从头合成途径中的关键酶,催化dUMP向dTMP转化,thyA的缺失导致dTMP从头合成途径受阻。
虽然dTMP可通过补救合成的方式由胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷合成,但是由于胸腺嘧啶类物质在原核、真核乃至人和动物的体液中含量甚微,故一般情况下,thyA基因缺失会导致细菌DNA合成受限死亡,只有在基本培养基中加入胸腺嘧啶或其核苷酸等成分,或者导入含有thyA基因的质粒,其缺失株才可生长(Belfortetal,1983);(Moronaetal,1991);(黄维等,2002)。
1.1.6Red重组系统
同源重组是多种生物体内普遍存在的一种生理现象,由体内的同源重组酶介导完成。
同源重组酶的作用机理不同于限制性内切酶,它不受内切酶位点限制,只要供体和受体DNA分子间具有一段相同的碱基序列(即所谓的同源臂)两者就能发生重组或替换(王军平等,2005)。
传统同源重组方法是利用RecA重组系统,应用该技术人们已经实现了多种形式的DNA修饰(O'Connoretal,1989);(Hamiltonetal,1989)。
但是以RecA同源重组为基础的基因敲除需要较长的靶基因同源臂,且重组率很低,操作相对费时。
大肠杆菌的λ噬菌体中存在一种有别于宿主的重组系统Red系统。
1998年,Murphy应用该重组系统实现在大肠杆菌染色体上进行基因重组(Murphy,1998)。
该系统由λ噬菌体的exo、bet和gam3个基因(也称α,β和γ)组成。
exo基因编码外切核酸酶Exo,Exo蛋白能结合在双链DNA的末端,降解双链DNA的5′端链,产生3′端突出。
bet基因的产物Beta蛋白能结合至单链DNA的3′突出端,防止DNA被单链核酸酶降解,同时启动互补链间的退火反应。
gam基因的产物Gam蛋白能与宿主RecBCD核酸外切酶相结合,从而抑制其对线形DNA的外切酶活性(Poteete,2001)。
Red重组系统由3种质粒构成:
(1)同源重组辅助质粒,其提供协助同源重组的exo、bet、gam3个基因,用于表达重组系统的3个蛋白;
(2)抗性模板质粒,该质粒含有两侧带有翻转酶结合位点(flipaserecognitiontarget,FRT)的抗性基因,用作抗性基因扩增模板;(3)抗性基因消除质粒
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