Usher综合征家系CDH23基因突变的鉴定研究眼科学专业毕业论文.docx
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Usher综合征家系CDH23基因突变的鉴定研究眼科学专业毕业论文.docx
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Usher综合征家系CDH23基因突变的鉴定研究眼科学专业毕业论文
Usher综合征家系CDH23基因突变的鉴定研究-眼科学专业毕业论文
解放军医学院硕士学位论文
英文缩略词表
缩写英文全称中文名称
CDH23cadherin23钙薪蛋白23基因
CNV∞'pynumbervariation拷贝数变异
FERG:
fullelectroretinogram全视网膜电图
GluEGlutamicacid谷氨酸
Indelinsertionanddeletion插入/缺失突变
LM-PCRligation-mediatedPCR连接反应介导的PCRNCBINationa1CenterforBiotechnologyInformation美国国立生物技术信息
中心
NGSnext-generationsequencing高通量测序技术
OCToptica1coherencetomography光学相干断层扫描
PCRpolymerasechainreaction聚合酶连反应
RPretinitispïgmentosa视网膜色素变性
SNHLsensorineuralhearingloss感音神经性耳聋
SNPssing1enucleotidepolymorphisms单核昔酸多态性遗传性耳聋,视网膜色
USHUshersyndrome
素变性综合征
UTRuntranslationregion非翻译区
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连续双向测序90个循环,用IlluminaPipelinesoftware(version1.3.4)读出原始测序数据,如图2.2。
GenomicDNASample1.2“嚣龋3000C++-·+气倦孓刀赋.镰撑..7.,-蔓j钐;jjl∞2于’于≥’l,一
L—一
r
,Shea
DNAfragmentswithabasepairpeakof150to200bp
Reparends
●
Blunt·endedfragmentswith5'-phosphorylatedends
Hvbf日j■l。
o
AddKlenowanddATP厂
’
3'-dAov.e。
rhang-··■
’adapters%慧黑+豢:
×荔薯
Ligateindexing·specific
怒)OOg瓤(一猕i。
暇Ⅺj≮姆蔷函
Adaptor·modifiedends
AMPureXPbeadpurihcation’
Removalofunligatedadaptors
PCRwithSuleSelectPrzmer:
I:
℃宅C脊’、、一,品品:
耳w·
andSureSelectPre.caplure
PreppedLibrary/o\\=鲨圈
rsePCRprimers
◆Reve
、、+。
,,L——----_一
图2-2:
AgilentV5试剂盒建库测序流程
(4)信息分析及筛选
获得原始测序数据后进行生物信息学分析。
首先对下机的原始数据(Rawreads)进行测序质量评估,去除低质量以及被接头污染的reads。
随后用BWA软件(BurrowsWheelerAligner)与人类基因组参考序列HGl9进行序列比对,与此同时进行序列捕获效果评价,用SOAPsnp软件和Samtools软件分别进行SNV(singlenucleotidevariant)和Indel(insertionanddeletion)的查询,生成目标区域碱基多态性结果,随后进行数据库(NCBIdbSNP,HapMap,1000humangenomedataset和databaseof100Chinesehealthyadults)的比对,并对找出的可疑突变进行注释、筛选,如图2—3。
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所有突变二二二=[二二二dbSNP数据库滤除
..............................J【............一二二二]=二1000G数据库滤除
.............................:
11.......................一
HapMap数据库滤除
—上
.......................jI:
.........一—一
挑选m外显f中鲫接突变
二二二工二二二
同义突变滤除
————厂—一ii
图2.3:
SNP/Indel筛选流程
2.2.2家系内及家系外验证
(1)目标基因序列的获取目标基因序列来自于Ensembl数据库,根据所筛查基因突变,目标片段选择突
变位点上下游150~200bp长度。
(2)对目标基因序列进行PCR扩增
①引物的设计
’
●
使用PrimerPremier软件设计所需扩增位点的引物,如表2.1,设计完成后由华大医学中心合成。
表2—1:
USH.HEN001家系患者CDH23基因突变位点引物设计
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@)PCR反应体系,如表2.2:
表2.2PCR反应体系
体系组成体积(u1)
纯化后PCR产物(Sng/100bp)l
单向引物(正向或反向)1.5
5×Buffer(美国ABI公司)1.5
2.5×Bigdye(美国ABI公司)O.5ddH205.5
③测序PCR反应条件每一循环经过变性(95"12)、退火(55"C)和延伸(72℃),DNA含量即增加一
倍,如图2-4:
95℃95℃
72℃
3min30sec\55℃/羔
5min
30cycle
图2_4:
测序PCR反应条件
④PCR产物质量检验
PCR产物需经1%琼脂糖凝胶电泳分析法或紫外分光光度计法检验其纯度,方法同1.2.4基因组DNA的鉴定。
(3)家系内Sallger验证选取家系中2名患者(II:
1、II:
4)和7名正常人(I:
1、I:
2、II:
2、II:
3、
m:
l、Ili:
2、III:
3)的基因组DNA中所筛选出的包含可疑突变位点的片段进行PCR扩增,并对扩增产物进行Sanger测序,所得测序结果与所发现的致病突变基因标
准序列进行比对,从而验证目标区域捕获高通量测序的结果。
(4)家系)l'Sanger验证
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选取与USH.HEN001家系无血缘关系的100名正常人作为对照,按照上述Sanger钡lJ序法进行可疑致病突变位点的家系外验证,方法同家系内Sanger验证。
2.2.3蛋白质保守性分析
蛋白质保守性指的是在进化过程中,基因所编码的蛋白质几乎不发生变化。
在进化理论中,某一蛋白“保守性好”说明该蛋白发生突变的几率低。
若是某一高度保守的蛋白发生变异,则很有可能是引起疾病的致病突变导致的。
因此,筛查致病突变位点后,进行蛋白质保守性分析十分必要。
(1)打开NCBI数据库(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)_点击‘'Protein'’,输入基因名称“CDH23”_÷Seareh_进入界面,显示不同物种的CDI-123基因编码
的蛋白一依次选择不同物种-÷选择的蛋白质大小应大于所要比对的P.Glu96GlufsX32---,点击FASTA_将氨基酸序列拷贝到文档里,并且标明物种(如图2.5)_以此类推,拷贝所有需要比对的物种氨基酸序列。
>[Homosapiens]p
MGOWATSCI雕'AWLLVLISGC脚籼FFTNHFFDTYLLISEDTPVGSSVTOLLAQDMDNq3PLVFGV
SGEEASRFFAVEPDTGIRrWLRQPLDRETESEFTvEFSVSDHQlSVITRKFNIQVGDVNDNAPTR丑《QPYSVRIPENTPVGTPIFIVNATDPDLGAGGSVLYSFQPPSOFFAIDSARGIVTVIRELDYETTQAYQLTVN刈TDQDKTRPLST飙AIIITDVQDMDPIFINLPYSTNII'EHSPPGTTvRIITAIDODKGRPRGIGYTIV
SGNTNSIFALDYISGVLTLNGLLDRENPLYSHGFILTⅥ(GTEI姻DRTPSDATVTTTFNILVIDINDNA
PEFNSSEYSVAITELAOVGFALPLFIQWDKDENL乱NSⅫEVZrLVGNNSI-IBFIISPTSVQ(;l(ADIRIR
张IPLDYETvDRYDFDLFA瓶SvPD壬fvGYAKvKITLIⅫNDNRPIFsQPLYNISLYENVTVGTSVLTVL。
图2-5:
Homosapiens部分氨基酸截图
(2)打开EⅧL—EBI数据库(http:
//www.ebi.ac.uk/)_点击Tools中的MultipleSequenceAlignment中的ClustalOmega,进入界面一÷将步骤
(1)中需比对的物种氨基酸序列拷贝到到STEPl-÷点击Submit_÷进入ClustalOmegaResults界面
_÷点击ShowColors,将不同氨基酸标注为不同颜色(说明:
‘宰’代表高度保守,c:
,代表较保守,‘.’代表保守,上述三种符号保守性逐渐递减)
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结果2.1目标区域捕获高通量测序参数
本研究选取已知的16个Usher综合征致病基因中发病率最高的10个
(CDH23,USHlC,PCDHl5,USHlGUSH2A,PDZD7,MY07A,GPR98,DFNB31,
CLRNl),定制针对性探针并合成基因芯片,通过芯片对目标基因编码区及临近剪切区的DNA进行捕获和富集,最后使用高通量测序平台进行突变检测。
由于系统误差,以致检测不能完全覆盖其所有外显子区,但总体覆盖度可达95%以上。
具体参数见表2.3。
表2.3:
目标区捕获测序参数
2.2检测可疑致病突变
本次研究在USH.HEN001家系中检出CDH23基因的突变c.6253+1G>A和
c.287288insG。
位点详情:
(1)CDH23;NM_022124;c.6253+1G>A;一;Intron45;Her:
该突变发生在剪接位点处,为一剪接突变。
(2)CDH23;NM_022124;c.287_288insG;p.Glu96GlufsX32;CDS3;Her:
框移突变,如图2-6。
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CD骨27:
N、1022124;c.6253+1G>A
TTT^GCCCTGCC^CCCTC^CTGTCC^TCTGCT^G^G^^CTGCCCGCCTGGT^^GC^GGGG^C^GGCCCC^GC^CCCC^C^^CC^GGGGCCGGTTGGTG
--._···---------I----···--_---_-·--··_····-·----_^-··-·--··---·--·····-
...--.------_---·-..--·--------‘·····------------^--··--------·o-------·
j
1Il|ll|IIIIII|1IIl|lJIIlII|lI|lI|lII|IIll|II|ll|1III||Il|I|lIIIllII|III1|I|lII|IIIIlI|||ll|IllIIlIl1Il||Il|IIIl|IllllI_IllIII『lllll|II·lII|II|fJl『l『IIIllI|JlllI
I』I『lll|『lI|llfl|l『l|lI『}II|lIlI|Il¨II|IlI{IIIl|ll|lfIl『『|『『lIlI『Ill1Il||『|1l|『lI|lf『|IIl|I
l|II|I||lI||lI·lI|lII『I||lIIII|Il|lII||IIl|l|『『l|lI|l
(’DH23;NAl022124;c.287288iasG:
P.Glu96GlufsX32
CTG^C^CTGlBCGTGGTGT∞CTCCGGC^GCC^CTGG^C^G^G^GGT^TG^CTTGCCC^T^CCCCTGCCCC^^TTCTCTCCTGGGG^C^GG
I『IgI『l
If|『IfIJ『IIII||『ll|lIII|lf『IIJl|lIIIIII|l『ll|l
--······--_.·····---------···--·-_---···---1-----·-·------···------·-.··-····---·-··--_^一1一
IIl|lIIl||ll|lJl|l||Il|IlII||lII|IlIl||lc|lI|lI|Il【lI|Il『|IJI
|II|lIllIl|II|lI|Il|l|||ll|Il|lIII||||Il『Il||ll|I|llI1IlI
ll|lI|IJ『I『『IlII|I『II』IJJIIf『Ii|Ii|IllI|l|l『llI|ll|『Il
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I||IlllJl||flJlIlf。
『I|IllI『1l『lII『Il||ll|Ir|IJ|Il|l
-T----·-···_··-_--_····-·---·--····__----···o--_。
·o--_--_···---··--···---···----_
IIIII|IIIIIIIII|IIlI¨lIIIIiIlIIllI|lllI|IIIIIlIl¨IIIl|Iil
lIlf|Il|IJII|lIIqIIl{IIII|||lI|Il|l|Il|lll1IllI|lII
||IIIlIl|lf『II1日l1||llIl『ll|『|fIll|IIl
图2-6:
目标区域测序结果如图显示为正链reads结果,检出CDH23基冈的可疑致病突变:
c.6253+1G>A和c.287288insG
2.3可疑突变的注释、筛选
本次检测,在受检者中共检出68个突变,除USHlG基因中未检出突变,其余基因中均检出突变。
65个为碱基置换突变,3个为插入突变。
59个突变影响氨基酸编码,9个突变对氨基酸编码无影响。
所有68个突变中,2个在互联网共享及本地数据库中的突变频率均<0.01,疑似致病突变。
详见表2—4。
表2—4患者可疑突变的注释、筛选
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千人数本地数
基因蝴列核麓豢庚獭妣姜星舭黼龃据库频据库频变异类型
率率
CDH23NM一022124c.6253+IG>AIN45Hetchrl0:
735510930ALikelypathogenic
£坠旦23盟丛Q丝!
丝!
!
1822塑迪鱼卫:
鱼业§垡丛鱼塑2£卫墅旦堕!
堑!
Q;Z12§!
!
§Q!
!
13堑!
塑!
Q垒坠麴!
Y鳇鱼!
g!
坐
2.4家系内及家系外验证结果
2.4.1家系内验证
患者II:
1、II:
4表现出CDH23:
c.6253+lG>A和c.287288insG两个位点的突变;患者的直系血亲I:
1、I:
2、III:
l、III:
2、III:
3,均未发病,基因检测结果显示上述两个位点中仅有1个位点突变,而另一位点正常;2名患者的配偶II:
2、II:
3,临床表型正常,基因检测均无上述两处基因位点的突变。
验证结果详见图2—7及表
2—5。
图2.7:
患者Sanger验证结果
表2-5患者家系内Sanger验证结果
突变位点标本编号杂合性序列片段
1.CDH23;NM一022124;II:
1Het5’.CCGCCTGATAAGCAGG.3’c.6253+lG>AII:
4Het5’.CCGCCTGATAAGCAGG.3’
I:
1Het5’.CCGCCTG芦汀AAGCAGG一3’I:
2N5’.CCGCCTGGTAAGCAGG一3’III:
1Het5’.CCGCCTG芦口AAGCAGG.3’III:
2N5’.CCGCCTGGTAAGCAGG.3’
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III:
3N5’一CCGCCTGGTAAGCAGG.3’II:
2N5’一CCGCCTGGTAAGCAGG一3’Ⅱ:
3N5’一CCGCCTGGTAAGCAGG一3’
2.CDH23;NM一022124;II:
1Het5’.CAGAGAGGTATGACT-3’c.287288insG:
II:
4Het5’一CAGAGAGGTp汀GACT-3’
p.Glu96GlufsX32I:
1N5’一CAGAGAGGTATGACTT_3’
I:
2Het5’一CAGAGAGGTATGACT-3’
III:
1N5’一CAGAGAGGTArGACTT-3’IIh2Het5’.CAGAGAGGTp汀GACT-3’IIh3Het5’一CAGAGAGGTATGACT-3’II:
2N5’一CAGAGAGGTATGACTT-3’II:
3N5’一CAGAGAGGTATGACTl'-3’
2.4.2家系外验证
将100名正常人DNA在chrl0:
73551093和c11r10:
73269980—73269981两个位点处进行扩增后测序,均未见c.6253+1G>A和c.287288insG突变。
2.5CDH23编码蛋白保守性分析结果
CDH23基因定位于10q22.1,是钙粘蛋白超家族的成员,其基因编码钙依赖性细胞粘附糖蛋白。
该蛋白由含有由27个细胞外钙黏蛋白重复序列,1个大的单次跨膜结构域和1个短的细胞质结构域组成,蛋白的27个胞外结构域表现出明显
的同源性并优先以相同的方式彼此连接。
按照材料与方法中的3.2.3蛋白质保守性
分析方法,选择包含人类在内的11个物种进行CDH23基因p.Glu96GlufsX32氨基酸保守性比对,发现该位点在11个物种中高度保守(图2—8)。
[MusDNDE‘LVFGVSGEEAS.AVEQDETSEhlTVEFSSDHQGw
【HomoDNDPLV?
GVSGEEASVQDETSETVEFSSDHQG
【syntheticDNDPLVFGVSGEEASVQDETSEh.}LTVEFSSDHQG[RousettusDNDPLVFGVSGEEASVE芑EQDETSETVEFSSDHQGN珊w
[HipposiderosDNDPLVFGVSGEEAS1h—H、^_】:
:
VV{{iQDETSEVEFSSDHQ6w[Eonycteri3DNDPLV三’GVSGE盼SVEQDETSEVEFSSDHQGw
E
[AsellisC[/SDNDPLVFGVSGEE五SVEQDET一,一.一∑_;工VSEVEFSSDHQGw
[MyotisDNDPLVFGVSGEBASiQDETSETVEFSSDHQGN
【ChaerephonDNDP工VFGVSGEEASVEQDETSET二二TVEFSSDHQGw
J_^.H—AVE
[TaphozousDNDPL’j三’GVSGEEASVEIQDET一:
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SETVEFSSDHQGl一ITw
[MiniopterusDNDPLVFGVSGEEAS1^一HVEf叩∞阳∞叩叩钾叩叩∞叩-誓茹誓I五五誓≥I誓QDET.SEP一王h|F?
F?
fIJTVEFSSDHQGi’ITw
图2.8CDH23基因蛋白质96氨基酸保守性分析说明:
高度保守,‘:
’较保守,‘.’保守,上述三种符号保守性逐渐递减,突变位置(红框所示)为高度保守。
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讨论
近年来,高通量测序的方法被广泛运用于分析视网膜变性疾病的致病基因,本研究采用目标区域捕获法,联合高通量测序平台进行突变检测。
较传统基因检测,不仅灵敏度有所提高,而且更加经济高效【8-lo】。
然而,由于目标区域捕获法预先将DNA打断为200bp左右的片段,若发生大片段缺失、复制与倒位重排,目标区域捕获法将无法检测。
本研究通过对每一步骤的质控,目标区域覆盖度可达99.76%。
本次研究,在USH—HEN001家系检出CDH23基因的致病突变c.6253+lG>A和e.287288insG,由于Usher综合征为常染色体隐性遗传,因此推测可能由以上两突变组成复合杂合突变导致疾病发生。
其中c.6253+lG>A为一剪接突变,该突变发生在剪接位点处,可能会对mRNA的剪接功能产生较大的影响。
而c.287288insG为一框移突变,该突变导致氨基酸编码蛋白发生提前终止,产生截短蛋白,可能会对蛋白质的结构和功能产生较大的影响。
CDH23基因位于10q22.1,编码钙依赖性细胞粘附糖蛋白【11】。
该蛋白是钙粘蛋白超家族的成员,由27个细胞外钙黏蛋白重复序列,1个单跨膜结构域和1个细胞质结构域组成,有研究认为,该蛋白的细胞外结构域表现出明显的同源性,并优先以同种方式相
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