磷酸盐缓冲液PBS配制方法.docx
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磷酸盐缓冲液PBS配制方法
实验方案镧铈对铜胁迫下豌豆种子萌发和生长的影响
1.La(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发影响的显效剂量筛选
(1)浓度梯度设计:
LaCl
3/CeCl
3溶液配置:
先配置1g•L-1的LaCl
3/CeCl
3溶液母液,然后将母液分别稀释成浓度为
5、10、
20、40,60mg•L-1梯度浓度,调节PH(HCL/NAOH)至
6.5,对照(CK)为PH调节至
6.5的去离子水。
重金属Cuso
4浓度的设置:
10、25、
50、100、
200、400mg•L-1,对照用蒸馏水。
(2)试材培养
种子预处理:
选取均匀饱满的豌豆种子用
0.1%HgCl
2溶液消毒15min,分别用自来水和去离子水洗净,常温下晾干备用。
(3)实验设置:
CK,La,Ce,Cu(共4组18个浓度57个样品)
(4)试材处理:
选取LaCl
3、CeCl
3和CuSO
4各个梯度溶液,豌豆种子经预处理后用各个梯度溶液浸没处理,对照用蒸馏水,置于25±1℃浸种24h后,将处理后种子均匀排列在直径9cm、垫有2层滤纸的培养皿中,每处理加入一定量水培养(以没过种子为标准),每处理3皿重复,每皿20粒。
指标测定方法:
种子发芽第三天测α—淀粉酶,第四天测发芽势,前三天测发芽指数和发芽率,第五天测量根长、茎长,第六天测根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、SO
D、PO
D、CAT、M
DA.
2.La(Ⅲ)和Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发及保护酶的影响
(1)试材培养
种子预处理:
选取均匀饱满的豌豆种子用
0.1%HgCl
2溶液消毒15min,分别用自来水和去离子水洗净,常温下晾干备用。
(2)实验设置:
在上一步骤中分别筛选出LaCl
3、CeCl
3的低剂量、适宜剂量、高剂量三个有效浓度和CuSO
4的一个有效浓度,分别记为A1,A2,A3;B1,B2,B3;C。
(3)实验步骤:
有以下几组:
A+C:
A1+
C、A2+
C、A3+C
B+C:
B1+
C、B2+
C、B3+C
A+B+C:
A1+B1+
C、A1+B2+
C、A1+B3+
C、A2+B1+
C、A2+B2+
C、A2+B3+
C、A3+B1+
C、A3+B2+
C、A3+B3+C
酸盐缓冲液(PBS)配制方法
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(
0.2M)
pH
0.2MNa2HPO4/ml
0.2MNaH2PO4/ml
7.061.
039.0
7.789.
510.5
7.891.
58.5
Na2HPO4·2H2O分子量=
178.050.2M溶液含
35.61g/L
Na2HPO4·12H2O分子量=
358.220.2M溶液含
71.64g/L
NaH2PO4·H2O分子量=
138.010.2M溶液含
27.6g/L
NaH2PO4·2H2O分子量=
156.030.2M溶液含
31.21g/L
0.01MPBS
PBS(135mMNaCl,
2.7mMKCl,
1.5mMKH2PO4,and8mMK2HPO4,pH
7.2)PBS缓冲液(pH
7.2~
7.4):
NaCl137mmol/L,KCl
2.7mmol/L,Na2HPO4
4.3mmol/L,KH2PO4
1.4mmol/L称7.9gNaCl,
0.2gKCl,
0.24gKH2PO4(or
1.44gNa2HPO4)和
1.8gK2HPO4,溶于800ml蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至
7.4,最后加蒸馏水定容至1L。
保存于4℃冰箱中即可。
母液的配制:
0.2MNa2HPO4:
称取
71.6gNa2HPO4-12H2O,溶于1000ml水
0.2MNaH2PO4:
称取
31.2gNaH2PO4-2H2O,溶于1000ml水
各种浓度PB(pH=
7.4)的配制:
先配
0.2MPB(pH=
7.4,100ml):
取19ml
0.2mol/L的NaH2PO4,81ml
0.2mol/L的Na2HPO4,即可。
然后只需将
0.2MPB(pH=
7.4)按相应比例适当稀释即可,如:
0.1MPB(PH=
7.4):
取500ml
0.2MPB,加水稀释至1000ml即可。
0.01MPB(PH=
7.4):
取50ml
0.2MPB,加水稀释至1000ml即可。
0.02MPB(PH=
7.4):
取100ml
0.2MPB,加水稀释至1000ml即可。
若需要NaCl的话,加入NaCl至
0.9%(g/100ml)即可。
另:
其它各种另PH值的
0.2MPB(100ml)配方:
pH
0.2MNaH2PO4(ml)
0.2MNa2HPO4(ml)
7.03862
7.88.
591.5
0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法
称取8gNaCl、
0.2gKCl、
1.44gNa2HPO4和
0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至
7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌(至少20分钟),保存存于室温或4℃冰箱中。
需要注意的是,通常所说的浓度
0.01M指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度,而非Na离子或K离子的浓度,Na离子和K离子只是用来调节渗透压的。
如果是用于免疫组化的话,则需要在配置的时候分别加入100u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。
PH
7.67.
47.27.0
H2O
NaCl
8.58.
58.58.5
Na2HPO4
2.22.
22.22.2
NaH2PO4
0.10.
20.30.4
PBS缓冲液
称取NaCl8g,KCl
0.2g,Na2HPO412H2O
3.63g,KH2PO4
0.24g,溶于900ml双蒸水中,用盐酸调pH值至
7.4,加水定容至1L,常温保存备用。
0.05mol/LPBS(磷酸缓冲液PhosphateBufferSolution,PBS)的配制:
甲液:
0.05mol/LNa2HPO4溶液:
称取磷酸氢二钠
9.465g
7.099g,加蒸馏水至1000ml;乙液:
0.05mol/LKH2P04溶液:
称取磷酸二氢钾,
9.07g
6.803g,加蒸馏水至1000m1。
将甲乙液分装在棕色瓶内,于4℃冰箱中保存,用时甲、乙两液各按不同比例混合,即可得所需pH的缓冲液,见下表:
pH甲液ml乙液mI
7.1770.
030.0
7.3880.
020.0
7.7390.
010.0
8.0495.
05.0
实验01根系活力的测定(TTCxx)
(二)仪器设备:
1.分光光度计;
2.分析天平(感量
0.1mg);
3.电子顶载天平(感量
0.1g);
4.温箱;
5.研钵;
6.三角瓶50ml;
7.漏斗;
8.量筒100ml;
9.吸量管10ml;
10.刻度试管10ml;
11.试管架;
12.容量瓶10ml;
13.药勺;
14.xx适量;
15.烧杯10ml、1000ml。
(三)试剂:
1.乙酸乙酯(分析纯)。
2.次硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉末。
3.1%TTC溶液准确称取TT
C1.0g,溶于少量水中。
定容到100ml。
用时稀释至各需要的浓度。
4.磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7)。
5.1mol/L硫酸用量筒取比重
1.84的浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml。
6.
0.4mol/L琥珀酸称取琥珀酸
4.72g,溶于水中,定容至100ml即成。
三、实验步骤
(1)TTC标准曲线的制作取
0.4%TTC溶液
0.2ml放入10ml量瓶中,加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。
再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。
然后分别取此液
0.25ml、
0.50ml、
1.00ml、
1.50ml、
2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。
(2)称取根尖样品
0.5g,放入10ml烧杯中,加入
0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,此后加入1mol/L硫酸2ml,以停止反应。
(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。
(3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提出甲月替。
红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比测出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
四氮唑还原强度(mg/g(根鲜重)/h)=四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]实验02脯氨酸含量的测定
(二)仪器设备:
1.722型分光光度计;
2.研钵;
3.100ml小烧杯;
4.容量瓶;
5.大试管;
6.普通试管;
7.移液管;
8.注射器;
9.水浴锅;
10.漏斗;
11.漏斗架;
12.滤纸;13剪刀。
(三)试剂
1.酸性茚三酮溶液:
将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中;
2.3%磺基水杨酸:
3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml;
3.冰醋酸;
4.甲苯。
三、实验步骤
1.标准曲线的绘制
(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶,分别盛入脯氨酸原液
0.5,
1.0,
1.5,
2.0,
2.5及
3.0ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为1,2,3,4,5及6μg/ml。
(3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。
(4)冷却后各试管准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。
(6)标准曲线的绘制:
先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/2ml)。
2.样品的测定
(1)脯氨酸的提取:
准确称取不同处理的待测植物叶片各
0.5g,分别置大管中,然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10min,(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。
(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。
(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30S,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000rpm下离心5min。
(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。
计算公式如下:
脯氨酸含量(μg/g)=[X×样重(g)。
实验03叶绿素含量的测定
(二)仪器设备:
1.分光光度计;
2.电子顶载天平(感量
0.01g);
3.研钵;
4.棕色容量瓶;
5.小漏斗;
6.定量滤纸;
7.吸水纸;
8.擦境纸;
9.滴管。
(三)试剂:
96%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸钙粉。
三、实验步骤
1.取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。
2.称取剪碎的新鲜样品
0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。
静置3~5min。
3.取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4.用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25ml,摇匀。
5.把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。
以95%乙醇为空白,在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算:
将测定得到的吸光值代入下面的式子:
Ca=
13.95A665-
6.88A649;Cb=
24.96A649-
7.32A665。
据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb:
mg/L),二者之和为总叶绿素的浓度。
最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量:
叶绿素的含量(mg/g)=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重(或干重)。
实验04植物组织中可溶性蛋白质含量的测定(福林-酚试剂法)
(二)仪器设备:
1.722分光光度计;
2.离心机;
3.恒温水浴;
4.定量加样器;
5.冷凝回流装置一套;
6.研钵;
7.离心管;
8.刻度移液管;
9.微量滴定管;
10.试管等;
(三)试剂:
标准蛋白质溶液:
称取25mg牛血清蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使终浓度为250μg/ml;试剂甲;试剂乙。
首先配制A液:
4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与
0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3,
0.1molNaOH);B液:
1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(
0.5%CuSO4·5H2O,
0.1%酒石酸钾钠)。
在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。
此为FolIn-酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于Folin试剂)的配备:
称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。
之后加入85%的H3PO450ml,浓HCl100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H。
冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以释放出过量的溴。
待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min)。
使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。
使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1mol/LH+酸,此为Folin-酚试剂乙液(Folin试剂)。
在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。
三、实验步骤
(一)标准曲线的绘制
1.取18×200mm试管7支,1~7编号,分别加入
0、0.
1、0.
2、0.
4、0.
6、0.
8、
1.0ml标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1ml,使每管含蛋白量分别为
0、25、
50、100、
150、200、250μg/ml。
2.用定量加样器给每支试管中加入5ml甲液,混匀,于30℃下放置10min。
3.再向试管中喷射加入
0.5ml乙液,立即振荡混匀,在30℃下准确保温30min。
4.以不加标准蛋白的1号管为空白,在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。
以标准蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(二)样品的测定
称取鲜样
0.8g,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,定容25ml过滤,取滤液
1.0ml于试管中,然后重复标准曲线绘制中的2~4步骤,以空白管调零,测定吸光度。
根据吸光度查标准曲线,求出样品中的蛋白质含量。
五、结果计算:
样品中蛋白的含量(mg/g)=C×VT/(Vs×FW×1000)
式中:
C-查标准曲线值(μg);VT-提取液总体积(ml);FW-样品鲜重(g);Vs-测定时加样量(ml)
粗蛋白量(%)=蛋白氮含量×
6.2
实验05植物组织中可溶性糖含量测定(苯酚法)
(二)仪器设备:
1.分光光度计;
2.水浴锅;
3.刻度试管;
4.刻度吸管。
(三)试剂:
1.90%苯酚溶液称取90克苯酚(AR),加蒸馏水10ml溶解,在室温下可保存数月;
2.9%苯酚溶液取3ml90%苯酚溶液,加蒸馏水至30ml,现配现用;
3.浓硫酸(比重
1.84);
4.1%蔗糖标准液将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重,精确称取
1.000克。
加少量水溶解,转入100ml容量瓶中,加入
0.5ml浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度;
5.100μg/L蔗糖标准液精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中,加水至刻度。
三、实验步骤
1.标准曲线的制:
向试管内加入1ml9%苯酚溶液,摇匀,再从管液正面以5~20S加入5ml浓硫酸,摇匀。
比色液总体积为8ml,在室温下放置30min,比色。
然后以空白为参比,在485nm波长下比色,以糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2.可溶性糖的提取取:
取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取
0.10~
0.30g,共3份(或干材料),分别放入3支刻度试管中,加入5~10ml蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25ml容量瓶中,反复漂洗试管及残渣,定容至刻度。
3.测定吸取
0.5ml样品液于试管中(重复2次),加蒸馏水
1.5ml,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定吸光度。
由标准曲线查出糖的量。
四、结果计算
按下式计算测试样品的糖含量:
可溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(μg)×提取液体积(ml)×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100
过氧化氢含量的测定
【仪器和用具】
研钵;移液管
0.2ml×2支,5ml×1支;容量瓶10ml×7个,离心管5ml×8支;离心机;分光光度计。
【试剂】
100μmol/LH
2O
2丙酮试剂:
取30%分析纯H
2O
257μl,溶于100ml,再稀释100倍;2mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线:
取10ml离心管7支,顺序编号,并按表40-1加入试剂。
表40-1测定H
2O
2浓度标准曲线配置表
离心管号
试剂(ml)
00μmol/LH
2O
200.10.
20.40.
60.81.04℃下预冷丙酮
1.00.
90.80.
60.40.205%硫酸钛
0.10.
10.10.
10.10.
10.1浓氨水
0.20.
20.20.
20.20.
20.23000r/min离心10min,弃去上清夜,留沉淀2mol硫酸
5.05.
05.05.
05.05.
05.0待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比色。
2.样品提取和测定:
(1)称取新鲜植物组织2~5g(视H
2O
2含量多少而定),按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算:
C´Vt
植物组织中H
2O
2含量(μmol/gFw)=FW´V1式中C—标准曲线上查得样品中H
2O
2浓度(μmol);Vt—样品提取液总体积(ml);V1—测定时用样品提取液体积(ml);
FW—植物组织鲜重(g)。
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