食品中酸性橙碱性橙和碱性嫩黄的测定编制说明.docx
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食品中酸性橙碱性橙和碱性嫩黄的测定编制说明
《食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定》
编制说明
吉林省疾病预防控制中心
二〇一二年四月
一、研究背景…………………………………………………………
二、任务来源………………………………………………………
三、制定标准的必要性和意义………………………………………
四、标准制定胡主要过程…………………………………………
五、制定标准的原则和依据…………………………………………
六、标准主要条款的说明……………………………………………
1、标准的名称………………………………………………………
2、标准的范围………………………………………………………
3、方法原理………………………………………………………
4、前处理条件………………………………………………………
5、仪器分析条件……………………………………………………
6、检出限………………………………………………………
7、线性范围……………………………………………………
8、准确度、精密度……………………………………………
七、标准验证情况说明……………………………………………
八、验证结论
九、本标准作为强制性地方标准的建议…………………………………
十、贯彻标准要求和措施建议…………………………………
十一、参考文献……………………………………………………
一、研究背景
碱性橙又叫盐基金黄、盐基杏黄、黄叱精盐酸盐、盐基杏黄块,为芳香胺类碱性染料。
分子式:
C12H13ClN4。
分子量248.72,属于偶氮类染料,主要用于腈纶、人造纤维、皮革、纸等的染色和棉织品、丝织品的印花,具有致癌、致畸变性。
图1碱性橙分子结构式
酸性橙又叫橙黄II、金橙II、二号橙,分子式:
C16H11N2NaO4S,分子量350.32。
酸性橙是一种酸碱指示剂,pH变色范围7.4(琥珀)~8.6(橙);10.2(橙)~11.8(红);萃取和光度测定阳离子表面活性剂、生物染色剂。
图2酸性橙分子结构式
碱性嫩黄又叫碱性嫩黄O、盐基淡黄O、盐基槐黄,分子式:
C17H22N3Cl,分子量303.84,是一种芳香胺类碱性工业染料,其结构示于图3。
主要用于醋纤、棉织品的染色,还用于纸张、皮革、油漆等的着色。
有资料表明:
碱性嫩黄对皮肤黏膜有轻度刺激,可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状,人接触或者吸入都会引起中毒。
图3碱性嫩黄的分子结构式
由于碱性橙、酸性橙、碱性嫩黄比食用色素更易在食品中染色,一些不法商贩利用其色泽鲜艳、着色稳定且价格低廉的特点,将其作为色素用于食品生产和加工,但是这些工业染料具有致癌作用,给消费者带来潜在的危害和巨大的风险,严重危害了消费者的身体健康。
国家卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单》的通知中明确规定禁止碱性橙、酸性橙、碱性嫩黄在食品中使用。
2011年卫生部将酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄作为食品安全风险监测项目提出,但是没有给出具体的国家标准检测方法。
二、任务来源
任务来源:
吉林省卫生厅
任务编号:
DBS22/008-2012
归口单位:
吉林省卫生厅
起草单位:
吉林省疾病预防控制中心。
三、制定标准的必要性和意义
近几年来,一些不法商贩利用一些廉价的工业染料,如酸性橙、碱性嫩黄和碱性橙等作为色素应用于食品生产与加工中,使食品色泽鲜艳,着色稳定,但是这些工业染料具有致癌作用,给消费者带来潜在的危害和巨大的风险,国家卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单》的通知明确规定禁止在食品中使用。
由于这些工业染料不属于食品添加剂范畴,所以现行国家、行业标准均没有规定其检测方法,目前检测碱性橙、酸性橙、碱性嫩黄的方法有示波极谱法、紫外可见分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱法。
示波极谱法、紫外可见分光光度法、薄层色谱法有其他色素会造成干扰,误差较大。
高效液相色谱法对于复杂基质的样品检测灵敏度低。
文献资料也很少有这三种工业染料同时检测的报道。
因此及时准确判断食品中是否存在这些非食用色素,建立一套快速、准确的食品中非食用色素的测定方法具有重要意义。
四、标准制定的主要过程
1、前期工作
实验室在2011年,通过查阅最新的资料和技术文献,确定了测定食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的技术路线,对方法的检出限、回收率、精密度进行了系统研究,建立了一个操作简便、灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法,为食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄检测提供了技术依据。
由于目前国家标准和地方标准中没有测定食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的方法,据此向吉林省卫生厅提出食品安全地方标准制定申请。
2、实验室间的验证工作
2012年5月,进行了实验室间的验证工作。
通过统计分析各个实验室的检测数据,验证了方法的准确度和精密度、检出限等。
参加验证的实验室一致认为:
该方法适用于测定食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的含量,具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。
五、制定标准的原则和依据
本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则,尽可能与国际通行标准接轨,注重标准的可操作性,严格按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分:
标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分:
化学分析方法》的要求进行编写。
六、标准主要条款的说明
1、标准的名称
食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定
2、标准的范围
本标准规定了食品中酸性橙、碱性橙和碱性嫩黄的测定方法,适用于腐竹、腐皮、豆腐干、海鱼、辣椒及其制品、花椒及其制品的测定。
3、方法原理
以含50%甲醇、1%甲酸的50mmol/L乙酸铵水溶液作为提取溶液,利用WAX弱阴离子交换固相萃取柱(60mg,3mL)对样品进行净化,UPLC-Ms/Ms测定酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄含量。
采用基质加标工作曲线内标法外标法定量。
4、前处理条件
称取1.0克试样于50mL离心管中,加入10.0mL提取溶液,超声提取30分钟,10000rpm离心10分钟,上清液转移至另一离心管中;残渣中加入10.0mL提取溶液再次提取,合并两次提取溶液。
取5.0mL样品提取液,用固相萃取柱平衡溶液稀释定容至50.0mL,过WAX固相萃取柱(3mL甲醇、3mL水、3mL固相萃取柱平衡溶液活化),用2mL淋洗液、2mL水淋洗,5mL洗脱液洗脱,收集洗脱液,氮气吹至近干,用样品稀释液定容至1.0mL,过0.22μm滤膜后超高效液相色谱-串联质谱测定。
在确定以固相萃取作为净化方法的基础上,考察了中性氧化铝柱、弱阴离子交换固相萃取柱、混合型阳离子交换柱的净化效果.实验发现酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄在中性氧化铝柱上无保留;阳离子交换柱上吸附太强,很难洗脱;在弱阴离子交换固相萃取柱上吸附强度中等,通过优化洗涤、洗脱溶剂中甲醇含量能达到净化目的.实验中分别以5mL5%、15%、25%、50%、85%氨水甲醇溶液对上样的弱阴离子交换固相萃取柱进行洗脱,分别收集洗脱液,浓缩、定容并测定,测定回收率结果见表1。
因此选择含5%氨水甲醇溶液为洗涤溶剂。
含5%甲醇溶液为洗脱溶剂,酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄均有较高回收率。
5、仪器分析条件
i.色谱参考条件
色谱柱:
AcquityUPLCBEHC18(1.7μm,2.1mm×50mm)。
柱温:
40℃。
流动相:
A相:
含0.1%甲酸的5mmol/L乙酸铵水溶液;
B相:
乙腈。
梯度洗脱情况见表2。
表2梯度洗脱程序
时间(min)
流速(ml/min)
流动相A
流动相B
0.0
0.3
90
10
5.0
0.3
10
90
6.0
0.3
10
90
6.5
0.3
90
10
10.0
0.3
90
10
进样量:
5μL。
流速:
0.3ml/min。
选择流动相时,比较了乙腈和含不同体积分数(0%-0.3%)甲酸的乙酸铵水溶液,发现当甲酸含量为0.1%时,各待测物的响应值相对较高,在很大程度上增加了目标物的分子离子化程度和检测灵敏度,所以最终选用乙腈和0.1%甲酸的乙酸铵水溶液为流动相,并采取梯度洗脱程序。
加标样品和标准品的MRM色谱图示于图4,从图4可见,优化后的色谱条件可以将4种目标物和基质干扰很好的分开,获得各组分的良好分离。
ii.质谱条件
离子化方式:
碱性橙、碱性嫩黄,ESI(+);酸性橙ESI(-);扫描方式:
多反应监测MRM;毛细管电压:
3.5KV;源温度:
110℃;脱溶剂气温度:
350℃;脱溶剂气流量650L/h。
质谱分析优化参数见表3。
表3酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量。
化合物
锥孔电压(v)
母离子(m/z)
子离子(m/z)
碰撞能量(eV)
酸性橙
20
329.1
155.9
127.8*
20
35
碱性橙
22
213.1
121.1*
77
20
18
碱性嫩黄
25
269.1
148.1*
122.0
25
25
*为定性离子
酸性橙分子结构中含有羟基基团,所以电离方式选择负离子电离。
在串联四极质谱仪的MS1中对化合物标准进行扫描,确定分子离子峰丰度最大的条件,得到酸性橙的母离子m/z329.1;在MS2中进行子离子扫描,改变诱导碰撞能量,选用丰度较大的2个子离子m/z155.9和m/z127.8分别作为定量离子和辅助定性离子,优化仪器参数使其在保证分辨率的条件下灵敏度最佳。
同样,根据碱性橙、碱性嫩黄分子结构的特征,实验选用电喷雾正离子(ESI+)电离模式,以流动注射泵连续进样对标准液进行MS1全扫描,找出准确的[M+H]+峰为碰撞诱导解离的母离子,继续对其子离子进行MS2全扫描,找出2-3个信号较强的碎片离子,再以母离子与子离子组成监测离子对,以多反应监测模式对待测物进行定性和定量检测,同时优化锥孔电压、碰撞电压、碰撞能量等质谱条件。
6、检出限
酸性橙7.0μg/kg;碱性橙5.0μg/kg;碱性嫩黄5.0μg/kg。
7、线性范围
酸性橙线性范围为7.0-500.0μg/kg;碱性橙和碱性嫩黄线性范围为5.0-500.0μg/kg。
8、准确度、精密度
在样品中加入酸性橙、碱性橙、碱性嫩黄标准物质,进行准确度与精密度实验,结果为酸性橙回收率为93.5%-111.0%,相对标准偏差为1.46%-7.56%;碱性橙回收率为93.5%-109.0%,相对标准偏差为1.38%-6.42%;碱性嫩黄回收率89.5%-108.0%,相对标准偏差为1.86%-7.91%,实验结果见表4-6。
表4酸性橙准确度与精密度试验(n=6)
样品
本底值(μg/kg)
添加量(μg/kg)
测定值(μg/kg)
回收率%
RSD(%)
1
0
0
0
0
0
0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
21.9
18.7
21.6
19.0
22.2
19.8
109.5
93.5
108.0
95.0
111.0
99.0
7.56
2
0
0
0
0
0
0
160.0
160.0
160.0
160.0
160.0
160.0
158.3
162.5
157.9
159.0
161.6
163.4
98.9
101.6
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