水稻遗传转化体系Protocol.docx

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水稻遗传转化体系Protocol

水稻遗传转化体系Protocol

Introduction

1．水稻的遗传转化研究历史与现状

20世纪80年代末,水稻的遗传转化首获成功。

1988年,3个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG介导法”等方法将外源基因导入到水稻中并获得再生植株[1~3]。

1991年,基因枪转化的方法在水稻中获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。

1993年，Chan等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。

Hiei等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体,建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系,使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。

此后,粳稻的转化方法被进一步优化,使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。

虽然Hiei等⑹建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难,但是许多籼稻的转化依然存在障碍,主要是转化效率低下。

因此,一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化,使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。

最近，Hiei和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果,采用幼胚作为外植体,籼稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高（一个幼胚可以得到5~13个独立的转化植株）。

2.转基因技术在水稻上的研究与应用[11]

a.转基因抗虫水稻

对于水稻最主要的害虫——螟虫（二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等）在水稻中

尚未发现有效的抗性种质资源.目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。

虽然水稻中已经发现和鉴定了19个抗褐飞虱的基因[12],但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异,抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。

b.转基因抗病水稻

见抗水稻病毒研究

c.转基因抗旱水稻

d.转基因营养高效利用水稻

e.转基因优质水稻

f.转基因高产水稻

g.转基因抗除草剂水稻

3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用

随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒基因工程上的广泛研究和应用[13~18]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。

目前，国内在这方面属于起步阶段，仅仅做了一些构建干扰载体和获得RNA干扰植株[19~27]，但并没有获得高抗植株，国外，特别是日本在这方面有着较大优势，OmuraT实验室分别在2009年和2010已获得了对RDV、RSV高抗植株[28,29]，另外Himani在2007年也获得了对RTBV高抗的植株[30]。

（重要是看以上文献，一定要认真体会）

Materialsandmethods

、接种

步骤：

1、保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。

2、拨去种皮

（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉

（2），用纸包好带入组培操作间。

3、（以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，

加入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml2%的NaClO（3）,覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27C恒温箱中暗培养（15）;

二、掐芽

种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，

将芽掐掉（16）,继续在27°C恒温箱中暗培养。

三、继代

掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），

转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。

大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。

四、农杆菌介导的水稻遗传转化

共培养（整个操作过程需8天）

第一天：

选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于27度暗培养4天。

第三天：

农杆菌划线28°培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。

第五天：

悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）（19）20ML的AMM液体培养基（20）中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。

第八天：

等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。

五、抗性愈伤的继代筛选

当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。

六、分化

从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。

分化间进行，25°（28），光14小时，暗10小时。

七、生根

超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗（29），在生根培养基上生长10天。

（30）分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。

八、炼苗

生根十天后开盖，加已晾两天或晒过的水，泡过培养基即可（28），2天后

28）用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。

（期间每天要加水，确保根都泡在水中）。

分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。

九、移栽大田

土、水提前晒上两天，移栽盆装4/5体积的土，用水浸透即可，不能太多水，刚好浸过土面最好。

移栽：

在盆上标记好，盆宽移栽两株，长四株；移栽时不能插深，植株能站住即可。

10天后可以施一点肥，不能太多。

20天后可以每10天施肥一次，同样不能太多，太多会烧苗（如烧苗，施肥3天后可以观察到，应马上将水换掉）。

要保证白天29°（30），晚上23°；光14小时，暗10小时。

（31）

Notes

（1）不用一粒一粒用手拨皮，在桌上垫一些白纸，用书压。

力道要掌握好，太用力把种子压碎了，用力不够只能去个别的种皮，效率低。

注意：

接触种子的纸必须是全白色的，不能有印刷有子的，否则用力压时，墨就着黑色上种子。

（2）不正常的种子，一律丢弃。

因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。

（3）a.20ml2%的NaClO的配制：

实验室买的是有效浓9%的NaCIO,所以取4.5ml9%的NaCIO力卩16ml蒸馏水即配成2%的NaClO

b.2%的NaClO现用现配，因为NaClO见光分解，所以配了就要赶紧用。

（4）20粒共三圈，外圈12粒，中圈7粒，里一粒。

（5）NB培养基的配置（800ml）：

实验准备：

所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗步骤：

取一升二角瓶f加24g蔗糖

依次加入80mlN6max（10X）⑹

16ml铁盐（50X）⑺

8ml肌醇（100X）（8）

4mlB5miin（200X）（9）

加多点（勿超500）三蒸水摇使其溶解，倒入1升量筒中，再加三蒸水定容至

780ml

J此时PH应为4.2-4.3

PH调至5.8（用pH计，KOH调）

加2.1g植物凝胶（10）

高压灭菌（121°20min）

J灭完前30min，拿出16ml有机，化为液态

加1.6ml2.4-D（1mg/ml）（11）至16ml有机（12）中

待培养基稍烫手抽滤（13），倒培养基（14）

⑹N6max（10X）的配制（配1L）：

①KNO328.3g

4.0g

4.63g

1.85g

1.66g或Cacl21.25g

②KH2PO4

@（NH4）2SO4

4MgSO47H2O

5Cacl22H2O

注：

a•①②③④一起溶解混匀成A,

b•⑤单独溶解，再与A交替混匀，以免长期存放产生沉淀;

c.4C冰箱保存；

（7）铁盐（50X）的配制（配500mL）:

1FeSO47H2O0.695gg

2NA2EDTA2H2O0.9325g

注：

a.①②分别溶解，再交替混匀，边加边摇匀；

b•棕色瓶装；

c.4C冰箱保存；

（8）肌醇（100X）的配制（配1L）:

10g肌醇（InositoI）用双蒸水定容至1L；4C冰箱保存;

（9）B5miin（200X）的配制（

配500mL）：

①MnSO4.H2O

0.758g

②H3BO3

0.3g

③ZnS047H2O

0.2g

④CuSO45H2O

0.0025g

⑤CoCI26H2O

0.0025g

⑥KI

0.075g

⑦NaMoO42H2O

0.025g

注：

a.一起溶解，二蒸水疋容至

500mL；

b•棕色瓶装；

c.4C冰箱保存；

（10）非琼脂粉。

（11）2,4-D（1mg/mI）配1100mI）：

加1ml无水乙醇用枪吸吹，可溶解。

再用纯水定容至100ml；

4C冰箱保存；

（12）有机（50X）的配制（配1L）:

①盐酸硫胺素（VB1）

0.5g

②盐酸吡哆醇（VB6）

0.05g

③尼克酸（烟酸）

0.05g

④水解酪蛋白

15g

⑤谷氨酰胺

12.5g

⑥脯氨酸

25g

⑦甘氨酸

0.1g

注：

a.以上药品均要求Sigma的，一起溶解，三蒸水定容至1L；

b•再分装，每个16mL；

c.用滤纸、漏斗过滤分装；

d.-20°冰箱保存；

e.用时提前拿出来；

（13）抽滤：

在超净台中把有机倒入一培养皿中，抽滤（先要试下过滤膜有没有装好：

注射器抽一些有机并抽入些空气，打出有机，若弹起，才可以进行抽滤。

所以通常过滤的应多准备几个；若使用一次性过滤器则直接抽滤即可；过滤膜为0.2um）,摇荡三角瓶（混匀），酒精灯烧瓶口再倒培养基。

（14）倒培养基：

a.六皿培养皿一摞，从下至上倒培养基

b．每皿倒一半稍多厚（水稻组培要厚点）,800ml倒22皿左右

C.快停时右手使三角瓶前倾点（可防倒到皿壁上）

d•移动培养皿摞时小心，慢点。

倒培养基后处理：

a.—升三角瓶、有机瓶子：

即刻冲洗。

b.过滤器：

过滤膜扔掉，冲洗过滤器（特别是过滤孔），打开晾干；若是一次

性过滤器则不必；

c.注射器：

抽开晾干。

注：

每次要用培养基提前2天倒好（保证无菌）；

（15）要做到每天观察，一但发现有污染的要及时处理：

长真菌的话整盘丢弃，但长细菌的可以将未污染的转移到新的培养基上。

16）左手镊子轻夹愈伤，右手镊子掐芽，为掐而非拔。

17）发黑的愈伤不要，黏糊的不要，要的是偏硬的愈伤。

18）经验：

一般晚上划线，第三天上午做侵染。

（例：

1.1晚上划线，1.3号上午做侵染，所以1号、2号用来做实验准备，高压滤纸培养皿，100ml三角瓶、枪头等。

）

（19）AS的配制：

9.81mgAS用ImIDMSO溶解即可；一般称98.1mg,用lOmIDMSO溶解,用1.5ml离心管分装，每管装1ml；-20°保存；

（20）AMM液体培养基的配制

（21）AS培养基（共培养培养基）的配制（8OOmI）：

（22）筛选培养基I（Hyg30）的配制（800ml）：

780mlNB+16ml有机+1.6ml2mgL-12,4-D+2ml100mg/mlCb+480ul

50mg/mlHyg

注：

a．100mg/mlCb母液配制：

1gCB用10ml双蒸水溶解（应为略黄色、澄清、

有刺激性味液体），4C保存

b．50mg/mlHyg：

默克牌的买来就应该是这个浓度，即1g/20ml

c.Hyg30:

是指潮霉素浓度为30mg/ml（即：

480ulX1g/20mg-800ul）。

d.有机、2,4-D、Cb、Hyg混匀，抽滤。

（23）可以看到愈伤一天一天开始慢慢褐化，就像死了一样；

（24）筛选培养基II（Hyg50）的配制（800ml）：

780mlNB+16ml有机+1.6ml2mgL-12,4-D+2ml100mg/mlCb+900ul

50mg/mlHyg

方法同上（略）

（25）分化培养基的配制（800ml）：

780mlNB+16ml有机+320ul（1mg/ml）NAA+8mgKT;pH5.8-5.9。

说明：

a.1mg/mlNAA母液的配制：

配50ml

称50mgNAA加1MKOH直至溶解（一般加1ml就可以溶解），再加

双蒸水定容至50ml。

不用高压，4°C保存。

b.分开抽滤：

16ml有机和320ul（1mg/ml）NAA混匀一起抽滤;

8mgKT用1ml1MKOH溶解,再加9ml双蒸水，混匀，抽滤；

（因为KT和有机、NAA会形成结晶，所以要分开抽滤）。

注：

8mgKT务必要称精确，用新的电子天平，勿用一楼的电子天平。

或者称24mgKT，加3ml1MKOH溶解,再加27ml双蒸水混匀，抽滤10ml即可。

c．800ml倒18个100ml三角瓶（每瓶约45ml）。

（26）经验发现团放比分散放置出苗率高。

（27）生根培养基：

1/2MS培养基；pH5.8-5.9。

（28）25°要恒温，不能一会28°一会25°，那样分化瓶壁上会出现很多水，影响苗的生长。

（29）生根培养基的配制

（30）操作很重要，严格执行，一大意就很容易污染。

操作时务必用长镊子，不能用手弄，用涂过酒精的手弄后期绝大部分会长真菌。

（31）这10天要常观察，一发现有污染的情况，即刻转移；

一般2天后就可发现根往瓶底部长，4天后发现苗明显转绿，茎变粗壮；

7天后发现有明显侧须根长出；根很多；

（32）一定要浸过培养基，没的话容易长菌；

（33）若长菌则换水。

（34）水稻高温下长势很好（大于28°）

（35）注意防虫，必要时15-30天打一次农药。

被带毒的虫子吃了的话，一但传上毒，实验就前功尽弃！

所以，在防虫方面，务必认真对待。

附录•转基因培养基的配方

1.NB培养基配方（基本培养基）

N6大量

工作浓度（mg/l）—

—母液：

10x,1L（g）—

KNO3

2830

28.3

（NH4）2SO4

463

4.63

KH2PO4

400

4

MgSO47H2O

185

1.85

CaCb2H2O

166

166

B5微量工作浓度（mg/l）母液：

100x,1L（g）

H3B0430.3

MnSO4H2O7.580.758

ZnSO47H2O20.2

KI0.750.075

Na2MoO42H2O0.250.025

CuSO45H2O0.0250.025

C0CI26H2O00250.0025

铁盐

工作浓度（mg/l）

母液：

100x

1L

（g）

jy

FeSO47H2O

N/EDTA

27.8

373

2.78

373

肌醇

工作浓度（mg/l）

母液：

100x

1L

（g）

丿J丿U|-|J

肌醇Myo-inositol

100

10

11—

iy丿

）4jui—ijiviyoiiiodiloi

有机成分

1\J\J

工作浓度（mg/l）

1

母液:

：

50X,

4L-

—

盐酸硫盐酸吡尼克酸Niacin水解酪蛋白

2.

AAM培养基配方

3.

MS培养基配方

铁盐

工作浓度（mg/l）

母液：

100x1L（g）

TAFTTL

FeSO4.7H2O

Na2EDTA

27.8

373

1\入・1w丿、，II—vy/

3.73

278

有机成分

工作浓度（mg/l）—

―母液：

50X,1L（g）——

CuSO4.5H20

0.0025

0.0025

肌醇

100

5

甘氨酸

0.1

盐酸吡哆醇（VB6）

尼克酸

0.5

05

0.025

0025

蔗糖

20000

琼脂

9-95

PH

58

羧卞青霉素（cb）

250mg/l

100mg/ml

潮霉素（hyg）

30-50mg/l

50mg/ml

利福平（rif）

50mg/l

20mg/ml

卡钠霉素（kana）

50mg/l

50mg/ml

四环素（tet）

4mg/l

10mg/ml

氨卞青霉素

50mg/l

50mg/ml

NAA奈乙酸

400ug/l

1mg/ml

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