高三生物 无菌操作技术.docx

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高三生物无菌操作技术

付兑市石事阳光实验学校高三生物1无菌操作技术

【本讲信息】

一、教学内容

无菌操作技术

二、考点清单

培养基配置与灭菌、微生物的分离技术、植物组织培养

三、全面突破

知识点1：

微生物营养要素及培养基配制过程、原则

1、微生物的营养要素

微生物的营养物质主要包括碳源、氮源、水、无机盐和生长因子五大类，列表总结如下：

营养物质

含义

作用

主要来源

碳源

能提供碳元素营养的物质

构成生物体细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质

无机碳源：

CO2、、NaHCO3；

有机碳源：

糖类、脂肪酸、花

生饼粉、。

氮源

提供氮元素的物质

合成蛋白质、核酸以及

含氮的代谢产物

无机氮源：

N2、NH3、铵盐、

硝酸盐；

有机氮源：

尿素、牛肉膏、蛋

白胨；

生长因子

生长必不可少的微

量有机物

酶和核酸的组分

维生素、氨基酸、碱基

水

在生物体内含量很高，在低生物体

内含量更高

不仅是优良的溶剂，而且可以维持生物大分子

结构的稳

无机盐

为微生物提供C、N元素之外的各种重要元素，包括大

量元素

细胞内组分，生理调节物质；酶的激活

剂

特别提醒：

微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐；对于异养生物而言，含有C、H、O、N的化合物既是碳源也是氮源，也可能是能源；NaHCO3既是无机盐，也是自养微生物的碳源；绝大多数微生物缺乏合成生长因子的能力或合成能力有限，所以要在培养基中加入生长因子。

2、微生物培养基的配制（以牛肉膏蛋白胨培养基为例）

（1）配制培养液

在200mL烧杯中加入100mL蒸馏水，再加入0.5g牛肉膏、lg蛋白胨、0.5gNaCl、1g琼脂，边加热边搅拌，配制成培养液。

（2）调节pH

采用pH试纸测试，调节培养基的酸碱度至7.0～7.2。

（3）分装

将培养基趁热分装到洁净的试管中.培养基的高度约为试管高度的1／5。

注意不要污染试管口，用棉花塞塞紧试管。

（4）包扎

将3～5支试管扎成一捆，外包1层牛皮纸或2层报纸，用线扎好。

在试管壁上注明培养基的名称、组别、配制日期。

（5）灭菌

高压蒸汽灭菌是常用的灭菌方法。

在温度为121℃，气压为1.0kPa的条件下灭菌20min。

切断电源，待压力表中指针指向“0”点后，取出灭菌物品。

（6）搁置斜面

待试管冷却至50℃左右，将试管口部枕在高约1cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然倾斜，斜面长度不超过试管总长的1／2。

3、微生物培养基的配制原则

（1）目的要明确（根据微生物的种类、培养目的）。

如培养基可由简单的无机物组成，生产用的培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴用的培养基内必须加入已知化

学成分的物质。

（2）营养要协调。

注意各种营养物质的浓度和比例。

（3）pH要适。

各种微生物适生长的pH范围不同。

如细菌、放线菌和真菌的最适pH分别为：

6.5～7.5、7.5～8.5、5.0～6.0。

4、高压蒸汽灭菌

（1）原理：

将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内；把锅内的水加热煮沸，并把其有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭；再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。

（2）设备：

主要是高压蒸汽灭菌锅，室中以手提式最为常用。

（3）使用方法

1）加水：

是指使用前在锅内加入适量的水。

2）装锅：

装入待灭菌的物品，不能太满，盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固螺栓，打开排气阀。

3）加热排气：

接通电源加热，待水煮沸后。

使蒸汽和空气一起从排气孔排出。

4）保温保压：

当压力表指针指到121℃时，调节热源，使压力维持不变，并开始计算灭菌时间，根据灭菌的物品确灭菌时间。

5）出锅：

当压力表中指针降至“0”点，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固螺栓，开盖，取出灭菌物品。

特别注意：

①使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一要把原先的空气排尽，否则达不到指的灭菌温度；注意恒温灭菌。

灭菌完成后要压力表中读数为“0”后，先放气再打开灭菌锅盖。

②灭菌是指杀死微生物的营养体、芽孢和孢子，而消毒仅是杀死微生物的营养体，防腐则是抑制微生物的生命活动。

知识拓展：

常用的灭菌方法包括灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线灭菌，化学消毒剂进行消毒可以配合紫外线灭菌，效果。

【典型例题】

例1.某打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。

首先对食用菌室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。

请回答下列问题：

（1）对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：

、、、、

。

其中提供氮源的是；提供能源的主要物质是

。

（2）微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的。

在烧杯中加入琼脂后要不停地，防止。

（3）将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后将若干个试管捆在一起，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，压力kPa，温度，时间。

灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。

如果棉塞上沾有培养基，此试管。

（4）使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入适量的水。

把锅内水加热煮沸并将其有的彻底排出后再将锅密闭。

解析：

本题考查牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分及其作用。

培养基的配置原则、方法以及灭菌的相关内容。

根据上述讲解内容，固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料包括五种成分，为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水以及凝固剂琼脂；其中牛肉膏和蛋白胨都含有氮元素，可以提供氮源，由于牛肉膏富含水溶性糖，还可以提供能源；配置培养基的原则是目的明确，营养要协调，pH要适，因此我们可以确培养基中各成分要有适合的比例，由于琼脂作为凝固剂，在加热熔化的过程中易糊底导致局部温度过高引起烧杯破裂，因此可采用不断搅拌的方法加以避免；高压蒸汽灭菌要求100kPa，121℃条件下持续半小时后关闭电源，待冷却后取出试管搁置斜面，如果试管的棉塞沾有培养基，未能避免污染培养物则该废弃不用；高压灭菌过程中，由于冷空气的密度大，所以加热煮沸后放出冷空气才能使锅内达到特气压和达到特的温度，否则灭菌效果差。

答案：

（1）牛肉膏蛋白胨水无机盐琼脂蛋白胨、牛肉膏牛肉膏

（2）比例搅拌琼脂糊底引起烧瓶破裂（3）100121℃　　15～30min废弃（4）冷空气

例2.分析下面培养基的配方：

KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂。

请回答：

（1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是

和。

（2）该培养基为培养基（按物理状态分），因为培养基中含有。

（3）想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？

如果有，又是如何进行选择的？

。

（4）在以尿素作为唯一氮源的培养基上分离的微生物一是尿素分解菌吗？

。

为什么？

。

解析：

本题考查培养基的类型、作用知识。

题中所给的KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O为无机盐，葡萄糖作为碳源、尿素作为氮源，琼脂作为凝固剂，因此冷却后的培养基为固体培养基；由于培养基中尿素作为唯一氮源，因此可以作为分解尿素的微生物的选择培养基；但是有些微生物可以利用尿素合成其他代谢产物，因此该培养基上培养的微生物并不一分解尿素。

答案：

（1）葡萄糖尿素

（2）固体凝固剂琼脂（3）有选择作用。

此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够分解尿素的微生物才能生长（4）不一。

因为有些微生物可以利用尿素分解菌代谢产生的含氮代谢产物生长繁殖。

例3.某小组同学为调查水中细菌的污染情况进行了，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。

请回答与此相关的问题。

（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了和。

除此之外，培养基还必须含有的基本成分是和。

（2）对培养基进行灭菌，该采用的方法是。

（3）为了尽快观察到细菌培养的结果，将接种了湖水样品的平板置于

中培养，培养的温度设在37℃。

要使该所得结果可靠，还该同时在另一平板上接种作为对照进行。

（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有

种细菌。

一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越。

（5）如果提高培养基中NaC1的浓度，可以用于筛选耐细菌，这种培养基被称为。

解析：

（1）蛋白质中含有C、N元素，为细菌培养提供氮源和碳源，淀粉只能提供碳源。

（2）培养基采用高压蒸汽进行灭菌效果好。

（4）不同微生物形成的菌落不同，有多种菌落即有多种细菌；污染程度越重，菌落总数越多。

（5）耐盐细菌可以在高浓度NaCl培养基中生存。

答案：

（1）氮源（碳源不作要求）碳源无机盐水

（2）高压蒸汽灭菌（3）恒温培养箱无菌水（4）多高（5）盐（或NaC1）选择性培养基

知识点2：

平板分离操作过程

1、平板划线法：

（1）几次烧灼接种环的目的

①取菌种之前烧灼的目的是杀死接种环上原有的微生物；②每次划线之前的烧灼目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线的菌种数目减少；③划线结束后烧灼的目的是杀死接种环上的微生物或细菌，避免细菌污染环境或感染操作者。

（2）从第二次以后划线操作总是从上一次划线末端开始，这样能够使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

2、涂抹平板法和稀释平板法

要注意无菌操作，特别是移液管要在酒精灯火焰周围使用，移液管不要接触任何物体；玻璃刮铲的灭菌方法是将玻璃刮铲的末端放在体积分数为70%的酒精中，取出时要将多余的酒精在烧杯中滴尽，然后在酒精灯上引燃，注意防火。

知识点3：

土壤中分解纤维素的微生物的分离

利用纤维素作为唯一碳源，可以选择出分解纤维素的微生物。

这类微生物能分泌纤维素酶，能将纤维素分解为小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要，还能改善土壤结构，以提高土壤肥力，还可以用来分解纤维素，生产乙醇清洁能源。

分离用的培养基使用固体培养基，要稀释土壤悬液，以确保获得纤维素分解菌的单个菌落便于纯培养。

稳培养基的pH可以用缓冲溶液（如H2CO3/NaHCO3）。

知识拓展：

1、分离微生物用选择培养基：

含高浓度氯化钠溶液的培养基可以选择金黄色葡萄球菌，加入青霉素的培养基可以选择出酵母菌、霉菌；以尿素作为唯一氮源可以选择出尿素分解菌，用无氮培养基可以选择出固氮细菌。

2、鉴别微生物用鉴别培养基，如伊红-美蓝培养基鉴别大肠杆菌，刚果红培养基鉴别纤维素分解菌，酚红培养基鉴别尿素分解菌。

【典型例题】

例1.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。

某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。

请回答下列问题：

（1）②中培养目的菌株的选择培养基中加入作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基（A.影响；B.不影响）细菌的数量，如果要测②中活细菌数量，常采用法。

（2）④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于；使用法可以在⑥上获得单菌落。

采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？

（3）如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？

（4）过程中如何防止其它微生物的污染？

解析：

题目中所筛选的细菌“只能”降解苯酚，故可采用以苯酚为唯一碳源的选择培养基筛选，用含除苯酚外其他碳源的培养基作为对照。

培养液中苯酚浓度下降的速度可反映该菌对苯酚的降解能力，严格灭菌、无菌操作可有效防止过程中的杂菌污染。

答案：

（1）苯酚A平板菌落计数（活菌计数或菌落计数）

（2）④含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚为唯一碳源稀释涂抹平板或平板划线分离避免培养过程产生的水分影响微生物的生长。

（3）用同样苯酚浓度的培养液培养不同菌株，一时间后，测培养液中苯酚含量。

（4）培养基灭菌，接种环灭菌，接种过程无菌操作。

例2.

（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑______、______和渗透压条件。

由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、______优点，因此常作为遗传学研究的材料。

（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和______；静止于空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能__________。

（3）若用稀释涂抹平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除严格操作、多次重复外，还保证待测样品稀释的_______。

（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小菌落特征对细菌进行初步的____________。

（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。

对于固体培养基采用的检测方法是_________。

（6）若用大肠杆菌进行，使用过的培养基及其培养物必须经过_______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。

解析：

（1）大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短

优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压条件。

（2）灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,所以对培养基和培养皿进行灭菌，消毒：

使用较为温和的物理或化学方法，仅能杀死物体表面或内部一对人体有害的微生物,操作者的双手需要进行清洗和消毒,紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构.

（3）稀释涂抹平板法是将菌液进行一的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养,保证样品稀释的比例适合.

（4）对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小菌落特征对细菌进行初步的鉴.

答案：

（1）温度酸碱度易培养生活周期短

（2）灭菌消毒损伤DNA的结构

（3）比例合适

（4）鉴（或分类）

（5）将未接种的培养基在适的温度下放置适的时间,观察培养基上是否有菌落产生.

（6）灭菌

知识点4：

植物组织培养

1、植物组织培养技术的操作流程：

准备（器材、药品）→配置（MS培养基）→灭菌→取材与接种→观察与记录（外植体生长情况）→转接（转换培养基诱导芽、根的分化，幼苗形成，然后移栽）

2、植物组织培养的用

快速繁殖优良植物株系品种、培育农作物品种（如有些杂种的无性繁殖）、保存并运输种子（低温或超低温）

【典型例题】

下图是植物组织培养的简略表示。

请据此回答：

（1）①表示，它能被培养成为④的根本原因是。

（2）②表示，它的特点是。

（3）若想制作人工种子，该选用（填编号）。

（4）若①是花粉则④是，这项技术可用在上。

（5）若①是胡萝卜根尖细胞，则培养成的④的叶片颜色是，这说明了根尖细胞。

（6）若用此项技术制造治疗烫伤、割伤的药物——紫草素，培养将进行到（填编号）。

解析：

本题考查植物组织培养的一般过程及用。

植物的组织培养是用离体的植物器官、组织或细胞经脱分化使它们分裂增殖产生愈伤组织，愈伤组织经再分化，成为具有根、芽的幼体。

植物的组织培养所依据的原理是植物细胞具有全能性。

单倍体育种过程中，用花粉产生单倍体的过程是利用植物的组织培养，经秋水仙素处理成为纯合子，成为可育的个体。

紫草素是从大量的紫草的愈伤组织中提取的。

答案：

（1）离体的植物器官、组织或细胞细胞中含有发育成为完整个体所必需的基因（全能性）

（2）愈伤组织高度液泡化的薄壁细胞组成，排列疏松而无规则

（3）③（4）单倍体单倍体育种（5）绿色具有全能性

（6）②

本讲小结

超前思维

下一讲我们将学习发酵技术实践，请同学们预习果酒、果醋的制作，腐乳的制作，以及发酵食品中特成分的检测方面的知识。

【导学】

（一）发酵技术的发展

1、发酵的概念：

利用微生物在和条件下的生命活动来制备

或其的过程。

2、发酵技术发展的四个阶段

天然发酵阶段

纯培养阶段

深层培养阶段

微生物工程阶段

特点

产品

（二）果酒与果醋的制作

1、果酒的有关知识通过而制成的含饮料，包括葡萄酒、、，葡萄酒又分为干红（葡萄汁和混合酿造）和干白

（去皮白葡萄汁酿造）。

2、比较果酒与果醋的制作的相关知识

果酒制作

果醋制作

菌种

是否需氧

反式

最适温度

（三）腐乳和泡菜的制作

1、豆腐乳是我国独特的传统发酵食品之一。

民间传统的生产豆腐乳的方法主要是。

腐乳的生产多采用进行发酵，毛霉能分泌复杂酶系，使得腐乳坯中的蛋白质缓慢水解，生成多种和，形成豆腐乳所特有的风味。

2、工业上批量生产豆腐乳的步骤主要包括接种、、。

3、泡菜的制作需要环境，利用乳酸菌将分解为乳酸；因为乳酸发酵的微生物种类很多，主要是，种类很多，分类上多属于链球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和明串珠菌属。

在业上常利用乳酸发酵制造，乳品厂利用乳酸发酵制作。

（四）发酵食品中特物质含量的测

你能说出亚硝酸盐和维生素C测的原理吗？

【模拟试题】（答题时间：

45分钟）

1、某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。

研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，地筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。

的主要步骤如下图所示。

请分析完成下列问题：

（1）培养基中加入化合物A的目的是筛选，这种培养基属于培养基。

（2）“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的，需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是。

（3）在上述操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是。

（4）转为固体培养时，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是，操作时采用灭菌的方法。

（5）结束后，使用过的培养基该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是。

2、选择培养是微生物最强有力的技术手段之一。

主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制环境条件，使仅适该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离得到所需的特微生物。

选择条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及多个方面进行综合选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养许多方面。

如图描述了采用选择培养方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的过程。

（1）本所需培养基为，碳源为。

（2）原理是。

（3）①—③重复培养的目的是。

（4）⑤的菌落是降解的微生物。

（5）⑥为组，⑦为组，设置⑥的目的是

。

（6）在接种操作过程中为防止污染注意的事项是。

3、根据各类微生物的形态结构特点和陈代谢类型，利用选择性培养基和鉴别培养基，结合显微镜检以及菌落特征，可以把混杂在一起的大肠杆菌、硝化细菌、乳酸菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、圆褐固氮菌分离开来。

下面是分离筛选的方法步骤，请根据各个步骤的条件，填写空的内容。

首先配制一不同性质的固体培养基，然后进行灭菌。

再将上述微生物的混合液分别接种到各种培养基上进行培养。

⑴用无氮培养基可以筛选出　　　　　　　　　　　　　　　。

⑵用不含有机碳源的选择培养基可以筛选出　　　　　　　　　　　。

⑶酵母菌的筛选需要在常规培养基另加入　　　　　　　　　　　　　。

⑷用加入了较高浓度的NaCl的选择培养基可以筛选出　　　　　　　　　　，或者根据菌落的颜色呈现　　　　　色，将其挑取单独培养。

⑸利用伊红－美蓝培养基培养混合菌，菌落呈　　　　色，并带有金属光的是　　　　，挑取单个菌落培养。

结合显微镜检和进一步用伊红－美蓝培养基鉴别来确。

⑹在无氧条件下培养混合菌，　　　　　　　　　　可以生长，加入一浓度的乳酸，使培养基pH充分降低，可抑制　　　　　　菌的生长，利用菌落特征，结合显微镜检，选取生长优势的菌落，即可分离出　　　　　　。

4、下图表示水稻（体细胞有24条染色体）的花药通过无菌操作，接入试管后，在一条件下形成试管苗的培养过程，已知水稻的基因型为AaBb.

（1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，在愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得、和小分子有机物营养物质。

（2）要促进花粉细胞分裂和生长，培养基中有和两类激素。

（3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再发育成具有根、茎和叶的植物体。

这一过程必须给予光照，其原因是利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。

（4）试管苗的细胞中含有条脱氧核苷酸链。

（5）培育出的试管苗可能出现的基因型有。

（6）这种利用花药离体培养成的试管苗属于体。

要使它繁殖后代必须采取的措施是。

（7）从细胞工程角度看这种育种方法叫。

试题答案

1、

（1）目的菌选择

（2）化合物A异养需氧型（3）防止外来杂菌的入侵（4）接种环灼烧（5）防止造成环境污染

2、

（1）选择培养基对羟基苯甲酸

（2）利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经选择培养，选择出能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物

（3）增大分解对羟基苯甲酸微生物的浓度

（4）对羟基苯甲酸

（5）对照说明通过选择培养确实得到了欲分离的目标微生物（6）操作都在酒精灯火焰的附近进行

3、⑴圆褐固氮菌　　　⑵硝化细菌　　⑶青霉素　　　⑷金黄色葡萄球菌　　金黄　⑸深紫　大肠杆菌　　⑹乳酸菌和酵母菌　酵母　乳酸菌

4、

（1）水矿质元素

（2）生长素细胞分裂素（3）叶绿体（4）24（5）AB、Ab、aB、ab（6）单倍用秋水仙素处理幼苗（7）植物的组织培养