大学课程酶工程复习13.docx
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大学课程酶工程复习13
⏹酶的分类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶5.异构酶6.连接酶(合成酶)7.核酸酶(催化核酸)
氧化还原酶:
包括脱氢酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等。
氧化-还原酶催化氧化-还原反应。
转移酶(Transferase)包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等。
转移酶催化基团转移反应,即将一个底物分子的基团转移到另一个底物的分子上。
不同于氧化还酶!
裂解酶:
这类酶可脱去底物上某一基团而且往往在底物上形成双键,或可相反地在双键处加入某一基团(加成反应)。
主要包括醛缩酶、水化酶、脱氨酶及脱羧酶等。
异构酶(Isomerase此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化,分别进行外消旋、差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移、分子内裂解等。
.核酸酶(催化核酸)Ribozyme:
核酸酶是唯一的非蛋白酶。
它是一类特殊的RNA,能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。
水解酶:
脂肪酶、糖苷酶、肽酶(蛋白酶)等,水解酶一般不需要辅酶的参与。
水解酶催化底物的加水分解反应。
工业应用最广泛的一类酶。
连接酶:
这类酶关系很多生命物质的合成,其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源,有的还需金属离子辅助因子。
分别形成C-O键(与蛋白质合成有关)、C-S键(与脂肪酸合成有关)、C-C键和磷酸酯键。
⏹酶的组成和结构特点:
根据酶蛋白的组成特点划分:
1.单体酶2.寡聚酶3.多酶复合体4.多酶体系1.单体酶(monomericenzyme):
仅有一条具有活性部位的多肽链,全部参与水解反应。
2.寡聚酶(oligomericenzyme):
由几个或多个亚基组成,亚基牢固地联在一起,单个亚基一般没有催化活性。
亚基之间以非共价键结合。
3.多酶复合体(multienzymesystem):
几个酶镶嵌而成的复合物。
这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
⏹多酶复合体通常是包括三个或三个以上的酶,组成一个有一定构型的复合体。
复合体中第一个酶催化的产物,直接由邻近下一个酶催化,第二个酶催化的产物又为复合体第三酶的底物,如此形成一条结构紧密的“流水生产线”,使催化效率显著提高。
例如丙酮酸脱氢酶系(E.coli):
丙酮酸脱羧酶(EⅠ)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(EⅡ)和二氢硫辛酸脱氢酶(EⅢ)。
⏹4、多酶体系
⏹具有一个以上催化活性的若干种酶蛋白构成的混合体系。
如催化脂肪酸合成的脂肪酸合成酶系。
⏹其多个酶蛋白有可能以非共价结合形成酶复合体,也可能是以各自游离的形式存在
酶的组成部分
⏹辅因子:
酶蛋白中非蛋白质部分,它可以是无机离子也可以是有机化合物(小分子)。
⏹辅酶:
有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。
(用透析的方法可以使之与酶蛋白分离而除去)与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物
⏹辅基:
有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基。
(用透析的方法不能够使它与酶蛋白分离)与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。
酶作为催化剂的显著特点
1.催化能力(高效性):
根据中间产物学说:
在酶促反应过程中,酶与底物会形成(酶-底物)复合物,复合物的形成使反应所需的活化能大幅度的降低,由此导致能够参与反应的有效底物浓度增加,反应速度上升。
2.专一性:
即酶只能对特定的一种或一类底物起作用,这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。
可分为:
绝对专一性:
有些酶只作用于一种底物,催化一个反应,而不作用于任何其它物质。
相对专一性:
这类酶对结构相近的一类底物都有作用。
包括键专一性和基团专一性。
立体异构专一性:
这类酶能够辨别底物不同的立体异构体,并且只对其中的某一种构型起作用,而不催化其它异构体。
包括光学专一性和几何异构专一性。
3.可调节性
⏹主要表现在两个方面:
酶浓度的调节与酶活性的调节
⏹酶浓度的调节:
(表现为生物对体内酶浓度的控制)
a.对于诱导酶,可以通过诱导或抑制的方式来调节酶的合成,从而控制细胞内酶的浓度。
b通过激素的作用来调节酶的生物合成。
c.酶蛋白的生物降解,在蛋白酶的作用下,可以将细胞内多余的酶蛋白水解掉,从而控制胞内酶浓度在合适的水平
酶活性的调节:
(改变细胞内现有酶的活性)
a.共价修饰调节在其它酶的作用下,在酶分子上共价的引入一个基团,从而改变它的活性(类似于共价修饰)。
常见的是磷酸化/脱磷酸化,腺苷酰化/脱腺苷酰化,乙酰化/脱乙酰化,尿苷酰化/脱尿苷酰化,甲基化/脱甲基化,S-S/SH相互转变,共6种类型。
b限制性蛋白水解作用对酶蛋白进行部分水解,从而使之活性得以表现,如酶原的启动。
(1).酶原(zymogen):
酶无活性的前体
(2).酶原的启动:
从无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。
(3).启动剂:
能使无活性的酶原启动的物质。
(4).酶原启动的本质:
酶原的启动,实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。
c.抑制剂和启动剂的调节作用
d.回馈调节常见于多步合成反应,其末端的产物往往是该合成途径第一个酶的抑制剂,其抑制作用受到其浓度的控制。
e.金属离子和其它小分子化合物的调节
f.能荷调节与能量代谢相关的酶,其活性的高低往往受到细胞内能量水平高低的调节。
如,能量水平较高时,细胞内与能量(ATP)再生有关的酶(如,糖磷酸激酶、丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶等)的活性将会降低。
g.别(变)构调节(allostericregulation
(1).别构调节
当酶分子与某些化合物非共价结合(结合部位不是酶的活性中心)后发生构象改变(发生在酶的活性中心!
),从而引起酶活性的变化,这种调节称别构调节。
受别构调节的酶称别构酶(或变构酶),引起酶的活性受到别构调节的化合物称效应物(或别构剂)。
正效应物——别构启动
负效应物——别构抑制
(2).别构酶的特点
(a)一般是寡聚酶,由多亚基组成。
(b)具有活性中心和别构中心,它们位于不同的亚基或同
一亚基的不同部位上。
(c)多数别构酶不止一个活性中心,活性中心间有协同效
应【酶和一个配体(底物,调节物)结合后可以影响
酶和另一个配体(底物)的结合能力】;有的别构酶
不止一个别构中心,可以接受不同化合物的调节。
(d)不遵循米氏方程,动力学曲线为S型(正协同效应)或表观双曲线(负协同效应)
别构酶的协同效应
——酶和一个配体(底物,调节物)结合后可以影响酶和另一个配体(底物,调节物)的结合能力。
正协同性:
一分子底物或配体的结合增加了酶蛋白与另一分子相同的或不同的底物或配体的亲和力。
负协同性:
一分子底物或配体的结合降低了酶蛋白与另一分子相同的或不同的底物或配体的亲和力
米氏方程式的推导
⏹Michaelis&Menten于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式,即著名的米氏方程(阐述反应速度与底物浓度相互间的关系)。
v=Vmax •[S]/Km+[S]
建立在中间产物学说的基础之上,并对反应过程进行了一定的简化!
!
!
中间产物”学说:
酶与底物先结合成一个复合物,复合物经过一定的转化后再分解成为产物和游离态酶。
米氏方程:
底物浓度与酶促反应速度的关系v=Vmax •[S]/Km+[S]
米氏方程式的推导
假设:
酶浓度远低于底物浓度;酶与产物(E+P)的逆向反应形成ES复合物的速率不明显(P的浓度很低的情况);E与S在反应的初期迅速结合,并达到稳定的ES浓度。
K1,K2,K3为反应的速率常数。
ES的生成速率:
v1=K1([E0]-[ES])[S]
ES的分解速率:
v2=K2[ES]+K3[ES]
当反应达到平衡时:
v1=v2即K1([E0]-[ES])[S]=(K2+K3)[ES]
则
化简①式得:
由于酶的反应速度v=K3[ES]③
将②式代入③式得
当底物浓度很高时,[E0]=[ES],酶促反应达到最大速度
即Vmax=K3[ES]=K3[E0] ⑤
⑤式代入④式得
⏹抑制作用是指在酶不变性的情况下,由于某些化学物质(抑制剂)与酶的结合(发生在酶的活性中心),影响了酶与底物的结合,从而使酶的催化活性降低或丧失。
抑制作用的分类
⏹A.不可逆抑制作用(非专一性不可逆抑制作用;专一性不可逆抑制作用).抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失,失活后不能用透析,超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活,这种抑制作用称之为不可逆抑制作用。
由于被抑制的酶分子受到不同程度的修饰,故不可逆抑制也就是酶的修饰抑制。
B.可逆抑制作用(竞争性抑制作用,非竞争性抑制作用,反竞争性抑制作用,混合型抑制)
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失,失活后能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活,这种抑制作用称之为可逆抑制作用。
这种抑制剂又可通过两种不同的方式与酶结合而抑制酶的活性。
这两种方式为同位元元元抑制作用和别构抑制作用。
⏹a.抑制剂与酶的活性中心相结合,阻断酶分子的结合基团或催化基团,或与酶-底物中间复合体结合,从而阻止底物形成产物。
这类抑制剂在酶分子上的结合部位基本上和底物相同或相近,故称为同位抑制剂,这种抑制作用也就叫做同位抑制作用。
⏹b.抑制剂和酶分子活性中心以外的部位相结合,通过酶分子空间构象的改变,从而影响底物与酶结合的催化效率。
由于抑制剂与酶的结合部位不同于底物的结合部位,故这种抑制剂称为别位抑制剂。
抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合,从而干扰了酶与底物的结合,使酶的催化活性降低,称为竞争性抑制作用。
竞争性的抑制速度方程为
⏹竞争性抑制的机理:
1抑制剂与底物在结构上有类似之处
2可能结合在底物所结合的位点(如结合基团)上,从而阻断了底物和酶的结合
3表观上降低了酶和底物的亲和力,即Km增大。
竞争性抑制的特点:
⑴竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物;
⑵抑制剂与酶的结合部位与底物和酶的结合部位相同;
⑶抑制剂浓度越大,则抑制作用越大;但增加底物浓度可使抑制程度减小;
⑷动力学参数:
表观Km值增大,Vm值不变。
非竞争性抑制
抑制剂既可以与游离酶结合,也可以与ES复合物结合,使酶的催化活性降低,称为非竞争性抑制
非竞争性抑制速度方程为
非竞争性抑制的特点:
⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似;
⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合;
⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响,故底物浓度的改变对抑制程度无影响;
⑷动力学参数:
Km值不变,Vm值降低。
酶与底物的结合模型——探讨酶与底物的结合方式
1.锁钥模型假说
⏹酶作为生物催化剂有一个重要特点,即实现酶催化功能的必要条件之一是底物必须在酶上结合。
⏹锁钥模型假说提出了结合部位概念。
结合部位与底物之间存在互补的特点,就像锁和钥匙的关系,因而造成酶催化反应有很强的底物专一性。
⏹结合部位一般由特定氨基酸侧链组成,有的酶中还有辅基参与,与底物有形状的配合,使底物的原子与侧链的原子有尽可能多的接近到范德华半径内。
⏹除范德华力,稳定底物结合的力还有离子间引力、氢键和疏水作用,侧链、辅基和底物之间存在相应的配合。
⏹按锁钥模型假说,酶的活性中心空间结构是刚性的。
2.诱导契合模型假说
⏹后来的研究发现自由酶的活性部位和底物间并不精确地像锁钥匙一般配合,从而提出了诱导契合模型假说。
⏹该假说认为,酶与底物结合时,结合力促使酶和底物分别发生一些构象的变化,使之更有利于催化反应的发生。
酶的构象变化可使结合更紧密,并使催化基团处于更有利于催化的位置上。
底物形变造成的应力状态则可能使发生反应的键变弱,降低反应的活化自由能使反应速度增加。
形变所需的能量则是由结合能提供的。
酶的活性部位:
它是酶蛋白上结合底物和将底物转化为产物的特定空间区域,通常是整个酶分子相当小的一部分,它可以是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
⏹1.活性部位的组成
⏹按功能,酶的活性部位包含底物结合部位和催化基团两部分。
⏹底物结合部位可有效地降低反应所需的自由能,是酶反应的必要基础。
降低反应自由能的因素包括邻近效应,定向效应和形变效应。
酶的活性部位的共同特点:
⏹1)活性部位通常只占整个酶分子体积的1%--
⏹2%。
酶分子的催化部位一般只有2—3个氨基酸残基组成。
⏹2)酶的活性部位是一个三维实体。
⏹3)酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的,而是在酶和底物结合的过程中,底物分子或酶分子,有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的。
⏹4)酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝(crevice)内。
是相当疏水的区域。
在裂缝内底物有效浓度可达到很高。
⏹5)底物通过次级键较弱的力结合到酶上。
⏹6)活性部位具有柔性或可运动性。
活性部位的形成
⏹1.活性部位的组成
⏹按功能,酶的活性部位包含底物结合部位和催化基团两部分。
⏹底物结合部位可有效地降低反应所需的自由能,是酶反应的必要基础。
降低反应自由能的因素包括邻近效应,定向效应和形变效应。
⏹催化基团实施具体的催化反应。
如酸碱催化,亲核催化等。
⏹形成活性部位的成分包括主链结构,侧链基团和辅基。
⏹主链形成活性部位的基础形状。
⏹侧链基团完成活性部位的构成(点睛之笔!
),是活性部位的主要成分。
⏹很多酶还包含金属或有机辅基,它们虽不是肽链的一部分,但紧密结合在酶分子中,并实际参与了活性部位的形成,有的是结合部位的一部分,有的本身是催化基团。
降低反应活化能的作用方式——邻近效应和定向效应
⏹邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后,使底物和底物(如双分子反应)之间,酶的催化基团与底物之间结合于同一分子(酶蛋白)上,从而使参加反应的有效浓度得以极大的升高,从而使反应速率大大增加的一种效应。
双分子反应的两个底物在酶的结合部位定向结合造成彼此靠近,比溶液中发生反应的可能性会高得多,相当于大大提高了反应物浓度。
底物与酶形成复合物后,使分子间的反应变成了(复合物)分子内的反应。
⏹定向效应是指反应物的反应基团之间以及酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定位产生的效应。
底物的邻近和定向增加了有序性,降低了反应自由能。
底物结合时墒减少所需要的自由能由底物结合时放能提供。
⏹形变效应:
当酶遇到其专一性底物时,酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低,产生“电子张力”,使敏感键的一端更加敏感。
底物分子发生形变,从而促使酶-底物中间产物进入过渡态。
底物在活性部位结合可能造成底物形变,造成底物分子内应力。
微环境影响:
⏹酶的活性部位可以形成一定的微环境,使结合于此的底物处于易发生反应的环境中。
⏹微环境包括:
1)特定的酸碱条件。
活性部位可能存在提供质子或接受质子的基团,甚至同时存在两种基团,使酸和碱的条件共存,促使酸碱催化的进行。
2)特定的极性条件。
离子的、极性的和非极性的侧链形成特定极性微环境,而增加或降低底物的极化,使底物处于易反应状态。
3)特定的氢键条件。
活性部位中会存在很多氨基,羟基,羰基,咪唑基,羧基等可形成氢键基团,通过和底物形成氢键促进反应进行。
以上的三种机制:
邻近和定向效应,形变效应及微环境效应均是从酶与底物相结合的角度阐述了酶催化反应的高效性,也说明了酶与底物形成复合物后反应所需的活化能大幅度降低的根本原因。
⏹
酶工程理论
酶的生产方法:
⏹提取分离法:
直接从各种动植物材料中提取所需要的酶。
在早期的酶学研究中,该方法应用较多。
该生产方法操作起来比较简单(纯粹的蛋白分离纯化过程);缺点是材料较难收集,生产工艺受到季节的限制。
常见的代表如:
木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶
⏹微生物发酵:
利用微生物发酵的方法合成酶。
操作过程相对较复杂(包括酶的发酵及分离纯化两个过程);但是生产工艺容易控制,可以实现大规模生产。
目前工业上应用的酶绝大多数用该方法生产。
⏹化学合成法:
利用化学的方法合成酶的过程。
成本非常高,而且合成的酶对分子量大小有要求。
⏹利用微生物产酶的优点归纳如下:
⏹
(1)微生物种类繁多、酶种丰富,且菌株易诱变,菌种多样,可以满足各类酶发酵生产的需求。
⏹
(2)微生物生长繁殖快,易提取酶,特别是胞外酶,因此酶的生产周期非常短。
⏹(3)微生物培养基来源广泛、价格便宜,生产工艺不受原材料的限制。
⏹(4)可以采用微电脑等新技术,控制酶发酵生产过程,生产可连续化、自动化,经济效益高。
⏹(5)可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术,选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。
因此,下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。
⏹产酶微生物:
菌种是发酵生产酶的重要条件。
菌种不仅与产酶种类、产量密切相关,而且与发酵条件、工艺等关系密切。
已经在自然界中发现的酶有数千种,目前投入工业发酵生产的酶约有50~60种。
它们的生产菌种十分广泛,包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。
常见产酶微生物的基本要求:
不是致病菌;周期短,产酶量高;易变异退化;好是产生胞外酶的菌种,利于分离;医药和食品用酶,还应考虑安全性:
凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!
⏹由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。
⏹非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。
大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速,而且营养要求低。
⏹酶的发酵工艺条件与控制:
1、培养基(营养要求)培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料,主要是合适的碳源和氮源,其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。
酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能(内因)的影响外,还受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。
⏹发酵过程中温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。
⏹种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质量。
在发酵过程中,微生物不断分解和同化营养物质,同时排出代谢产物。
由于这些产物都与pH有直接关系,因此发酵液pH在不断发生变化。
生产上常根据pH的变化情况作为生产控制的根据。
⏹酶的破碎方法机械(匀浆)法2)超声波法3)冻融法4)渗透压法5)酶消化法
6)化学破碎法,其中包括①有机溶剂处理常用有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。
机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏,从而改变细胞膜的透过性,再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。
例如,将细胞悬浮在10倍体积的预冷至-20℃的丙酮之中,搅拌均匀,待自然沉降后弃上清液,抽滤得细胞,再用2.5倍体积的-20℃丙酮洗涤,抽干后,把得到的细胞立即放入真空干燥器中,除去残余的丙酮,得到细胞干粉,可长期保存,使用时再用水或缓冲液把胞内的酶提取出来。
②表面活性剂处理。
面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏,增加膜的透过性。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。
大多数酶能溶解于水,可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取;有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。
常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。
其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强,提取效果较好,已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、胆碱酯酶等的提取。
⏹酶的提取:
(1)盐溶液提取
(2)酸溶液提取(3)碱溶液提取(4)有机溶剂提取
酶的纯化方法
⏹1)根据分子大小而设计的方法。
如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。
⏹
(2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。
⏹(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法,如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。
⏹(4)按稳定性差异建立的分离方法,如选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法等。
⏹(5)按亲和作用的差异建立的分离方法,如亲和层析法、亲和电泳法等。
酶活力(Enzymeactivity):
酶活力是指酶催化反应的能力
⏹比活力(Specificactivity):
比活力是指单位蛋白质(每毫克蛋白质)所含有的酶活力(单位/毫克蛋白)。
比活力是酶纯度的指标,比活力愈高表示酶愈纯,即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。
但是,比活力仍然是个相对酶纯度指标。
要了解酶的实际纯度,尚需采用电泳等测定方法。
⏹回收率(Yieldpercent):
回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。
它表示提纯过程中酶的损失程度,回收率愈高,其损失愈少。
⏹提纯倍数:
提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。
它表示提纯过程中酶纯度提高的程度,提纯倍数愈大,提纯效果愈佳。
⏹酶活力的测定——酶促反应初速度的测量
⏹原理:
通过测定某一特定反应的产物生成速率或底物消耗速率来衡量酶活力的高低。
⏹设计酶促反应:
选择参与反应的底物,并由此确定了该反应的产物形式。
⏹确定酶促反应的条件:
温度与pH
⏹确定初速度的条件:
即确定反应的时间
⏹确定终止反应的方法:
热处理;强酸处理;强碱处理等。
酶纯化评价的实例
固定化酶:
它是通过物理的或化学的手段,将酶束缚于水不溶的载体上,或将酶束缚在一定的空间内,限制酶分子的自由流动,但能使酶充分发挥催化作用;过去曾称其为水不溶酶或固相酶。
固定化酶的优点
(1)极易将固定化酶与底物、产物分开;产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺.
(2)可以在较长时间内反复使用,有利于工艺的连续化、管道化。
(3)酶反应过程可以严格控制,有利于工艺自动化和微电脑化。
(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。
(5)较能适应于多酶反应。
(6)酶的使用效率提高,产物得率提高,产品质量有保障,成本低。
固定化酶也存在一些缺点:
(1)酶固定化时酶的活力有所损失。
同时也增加了固定化的成本,使工厂开始投资大。
(2)一般只适应水溶性底物和小分子底物。
(3)与完整细胞比较,不适于多酶反应,特别是需要辅因子的反应,同时对胞内酶需经分离后.才能固定化。
⏹固定化的一般方法:
吸附法(包括电吸附法)利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌吸附在其表面上。
特点是酶与载体间是一种弱的作用;酶的活性中心不易被破坏。
结合较弱,酶易从载体上脱落。
⏹结合法包括离子键结合法(酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。
)和共价结合方法(酶以共价键结合于载体的固定化方法。
)
⏹交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。
也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
⏹包埋法是酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使酶固定化的方法
固定化后酶性质的变化
1.固定化对酶活性的影响:
酶活性下降,反应速度下降
2.固定化对酶稳定性的影响
(1)操作稳定性提高
(2)贮存稳定性比游离酶大多数提高。
(3)对热稳定性,大多数升高,有些反而降低。
(4)对分解酶的稳定性提高。
(5)对变性剂的耐受力升高
3.固定化后酶稳定性提高的原因:
a.固定化后酶分子与载体多点连接。
提高了酶分子结构的“刚性”。
b.固定化载体创造的微环境更有利于酶的稳定。
c.抑制自降解,提高了酶的稳定性。
4.pH的变化。
H对酶活性的影响:
1)改变酶的空间构象
(2)影响酶的催化基团的解离(3)影响酶的结合基团的解离4)改变底物的解离状态,酶与底物不能结合或结合后不能生成
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