第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段.docx
- 文档编号:7844447
- 上传时间:2023-01-26
- 格式:DOCX
- 页数:14
- 大小:336.86KB
第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段.docx
《第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段.docx(14页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
第十五节多聚酶链式反应扩增DNA片段
多聚酶链式反应扩增DNA片段
主讲:
黄冈中学优秀生物教师 王小敏
★课题目标
1、了解PCR技术的基本操作;
2、理解PCR的原理;
3、讨论PCR的应用。
★课题重点:
PCR的原理和PCR的基本操作。
★课题难点:
PCR的原理。
一、基础知识
(一)细胞内DNA复制条件分析
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3′端起点
(二)细胞内DNA复制过程
1、DNA的反向平行结构:
(1)核苷酸分子的结构与方向性:
(2)DNA分子的平面结构:
2、DNA聚合酶的特性:
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链。
因此,DNA复制需要引物。
3、DNA合成的方向:
5′→3′合成
(三)PCR的原理
1、DNA分子的热变性原理:
2、体外DNA复制的条件(PCR反应的条件)
①DNA模板;
②四种脱氧核苷酸;
③两种引物:
分别与两条模板链相结合;
④耐高温的聚合酶(不需解旋酶);
⑤缓冲液:
模拟核基质,维持pH基本不变;
⑥温控设备:
严格控制温度(PCR仪)。
3、PCR的反应过程
(1)三个基本步骤——变性、复性和延伸。
(2)反应循环数:
25—30。
(3)扩增倍数:
106—109。
第一轮反应:
4、循环特点
①上一次循环的产物为下一循环的模板;
②子代DNA中只有2个DNA含有最初母链的一条;
③其它子代DNA分子都为双引物形式;
④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N。
二、实验操作
1、PCR反应体系:
缓冲液、DNA模板,四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物,水。
2、操作步骤
①(准备)按配方将所需试剂摆放在实验桌上;
②(移液)用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分;
③(混合)盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁;
④(离心)将微量离心管放在离心机上;
⑤(反应)将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序。
三、操作提示
1、避免外源DNA污染:
所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
2、缓冲液和酶分装成小份,-20℃低温保存。
使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。
3、在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
所有的成分都加入后,盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管的侧壁,使反应液混合均匀,再将微量离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在离心管底部,再放入PCR仪中进行反应。
目的:
避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。
四、结果分析与评价
1、DNA含量的测定原理:
DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。
可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。
2、具体方法
①将样品进行50倍稀释:
取2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水。
②以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。
③加入步骤1中的DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值。
④根据下面的公式计算DNA含量:
DNA含量(μg/ml)=50×(260nm的读数)×稀释倍数
课堂小结:
-返回-
同步测试
一、选择题
1、DNA分子复制时,解旋的两条链中( )
A.仅一条作为复制模板
B.两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子
C.两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子
D.两条链作为模板,各自合成一条子链,然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子,两条新链结合成一个全新的DNA分子
2、下列关于DNA复制过程的正确顺序是( )
①互补碱基对之间氢键断裂
②互补碱基对之间形成氢键
③DNA分子在解旋酶的作用下解旋
④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对
⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构
A.①③④②⑤ B.①④②⑤③
C.①③⑤④② D.③①④②⑤
3、下列各项过程中,遵循“碱基互补配对原则”的有( )
①DNA复制 ②RNA复制 ③转录 ④翻译 ⑤逆转录
A.①②③④⑤ B.①②③④
C.①②③⑤ D.①③④⑤
4、实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是( )
①酶 ②游离的脱氧核苷酸 ③ATP ④DNA分子
⑤mRNA ⑥tRNA ⑦适宜的温度 ⑧适宜的酸碱度
A.①②③④⑤⑥ B.②③④⑤⑥⑦
C.②③④⑤⑦⑧ D.①②③④⑦⑧
5、利用PCR技术,把一个双链DNA分子当作第一代,经过3次循环,在第四代DNA分子中,有几条第一代脱氧核苷酸的长链?
( )
A.2 B.4
C.8 D.16
6、关于DNA分子的叙述中,正确的是( )
A.DNA的两条链是极性相同,同向平行
B.DNA的两条链是极性相同,反向平行
C.DNA的两条链中极性不同,反向平行的
D.DNA的两条链是极性不同,同向平行
7、假设PCR反应中,只有一个DNA的片段作为模板,请计算在30次循环后,反应物中大约有多少这样的DNA片段( )
A.215 B.230
C.260 D.231
8、DNA的合成方向总是( )延伸。
A.从DNA分子的左端向右端
B.从DNA分子的右端向左端
C.从子链的5′端向3′端
D.从子链的3′端向5′端
9、要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行,需要严格的控制( )
A.氧气的浓度 B.酸碱度
C.温度 D.大气的湿度
10、DNA分子经PCR反应循环一次后,新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与( )
A.模板母链相同 B.非模板母链相同
C.两条模板母链相同 D.两条模板母链都不相同
11、在( )的温度范围内,DNA的双螺旋结构解开。
A.10-20℃ B.80-100℃
C.20-30℃ D.40-60℃
12、关于DNA的复制,下列叙述正确的是( )
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
13、下列有关PCR描述,不正确的是( )
A.是一种酶促反应
B.引物决定了扩增的特异性
C.扩增对象是DNA序列
D.扩增对象是氨基酸序列
CDADACBCCBBCD
二、非选择题
14、PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下,合成许许多多相同片段的一种方法,利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段,“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。
请结合有关知识,回答有关此技术的一些问题:
(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增,依据的原理是:
____________________。
(2)在实验条件下,DNA分子进行扩增,除了所要扩增的DNA片段处,还需要__________、和__________、__________等条件。
(3)某DNA片段有160个碱基,其中有腺嘌呤35个,若让该DNA分子扩增三次(即复制三次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是__________和__________个。
显示答案
14、
(1)DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对
(2)四种脱氧核苷酸、能量、酶
(3)245、315
-END-
课外拓展
PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。
出现假阴性结果的常见原因有:
TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制;引物设计不合理;提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当;循环次数不够;等等。
当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶,并增加5~10次循环。
为了防止假阴性结果的出现,在选用TaqDNA聚合酶时,要注意用活力高、质量好的酶。
同时,在提取DNA模板时,应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物,如酚、氯仿等的存在。
尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高,但也不允许有机试剂的污染。
PCR扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况,尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增,因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。
此外,样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。
为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR操作时要注意做到:
隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。
-END-
高考解析
例1、新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。
下列技术(或仪器)与应用匹配正确的是( )
A.PCR技术——扩增蛋白质
B.杂交瘤技术——制备单克隆抗体
C.光学显微镜——观察叶绿体的基粒
D.花粉离体培养——培育单倍体植物
答案:
BD
解析:
本题主要考查学生的理解能力。
PCR技术只能用来扩增核酸,不能用来扩增蛋白质;利用光学显微镜无法观察到叶绿体。
例2、请回答基因工程方面的有关问题:
(1)利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。
图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。
从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_________。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。
某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图),请分别说明理由。
①第1组:
____________________________;②第2组:
_____________________。
(3)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒,得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对),请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。
答案:
(1)15/16
(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3)见下图
-END-
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段 第十 五节 多聚酶 链式反应 扩增 DNA 片段