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山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响
山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响
【摘要】目的:
研究山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响。
方法:
采用MTT法检测山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响。
结果:
不同浓度的山慈菇提取物对HT29细胞增殖均有抑制作用,且抑制率呈时间、剂量依赖关系;山慈菇提取物干预后诱导HT29细胞凋亡(P<0.01)差异有统计学意义;山慈菇提取物诱导细胞凋亡过程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增强,Bcl-2蛋白表达明显减弱(P<0.05)。
结论:
山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞有明显的促凋亡作用,其机制可能与上调Cyt-C、Bax、Caspase-3下调Bcl-2蛋白的表达有关。
【关键词】山慈菇提取物;结肠癌HT29细胞;凋亡
【中图分类号】R282.71【文献标志码】A【文章编号】1007-8517(2016)16-0017-03
Abstract:
ObjectiveToinvestigatetheeffectsofCremastraappendiculataextractonproliferationandapoptosisinhumancoloncancerHT29cells.MethodsUsingtheMTTassaytodeterminethecellinhibitionratesonhumancoloncancerHT29cells;theflowcytometrytodeterminetheapoptosisrates;WesternblottechnologytodeterminetheexpressionsofCyt-C、Bcl-2、BaxandCaspase-3protein.ResultsCremastraappendiculataextractinhibitedthehumancoloncancerHT29cellsinatimedependentanddosedependentmanner.theapoptosisratesofthecellswereincreasedafterbeingculturedbyCremastraappendiculataextract;theexpressionsofCyt-C、BaxandCaspase-3proteinwereincreasedandtheexpressionofBcl-2proteinwasdecreased(P<0.05).ConclusionsCremastraappendiculataextractcaninducetheapoptosisofHT29cellsbyamechanismthatmayberelatedtoincreasetheexpressionofCyt-C、BaxandCaspase-3proteinaswellasdecreasetheexpressionofBcl-2protein.
Keywords:
CremastraAppendiculataExtract;HumanColonCancerHT29Cells;Apoptosis
结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一,其发病率、死亡率逐年增高,随着手术、放疗、化疗等的进步,早中期结肠癌治疗效果明显提高,但对于中晚期、高龄及难手术患者缺少有效的治疗方法。
目前,越来越多的医务科研工作者将目光投向天然动植物的研究,从中寻找可以防治肿瘤的有效成分,日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点[1-2]。
山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一,为兰科植物中杜鹃兰、独蒜兰及云南独蒜兰的干燥假鳞茎,具有解毒、化痰、散结等功效,临床上常以配伍用药的形式应用于各种肿瘤的治疗,其中包括结直肠癌[3]。
现代药理研究表明,山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抗炎以及影响造血系统等作用,但其抗肿瘤的作用机制尚未完全阐明[4]。
研究拟探讨山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响,以期为山慈菇运用于结肠癌的治疗提供实验依据。
1仪器与材料
1.1仪器细胞培养箱MCO-175(日本Sanyo公司);流式细胞仪6HT2L(美国GuavaEasyCyte公司);BX50显微镜(日本Olympus公司);超净工作台VD1320(哈尔滨东联技术开发有限公司);高速冷冻离心机CR21(日本Hitachi公司);凝胶成像仪及凝胶成像分析系统GelDOC2000(美国Bio-Rad公司)。
1.2材料山慈菇提取物(沈阳药科大学植物化学教研室提供,纯度为98%。
称取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热,冷却过滤,浓缩至200mL,加入95%乙醇冷藏洗涤,最后获得干粉6g,使用培养基配置成所需要的浓度)。
胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);RPMI1640培养液(Gibco生物工程有限公司);0.5%二甲基亚砜、MTT(DMSO,美国Sigma公司);AnnexinV/PI凋亡试剂盒(南京凯基生物技术有限公司),Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(美国SantaCruz公司);吸附(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。
2方法
2.1人结肠癌细胞HT29的培养将人结肠癌细胞株HT-29置于56℃、30min10%胎牛血清、RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养,每2~3天传代一次,留取对数生长期的细胞用于实验。
2.2MTT法检测细胞抑制率取对数生长期细胞,用0.25%胰酶消化并收集细胞,以RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL,接种于96孔培养板中,每孔0.1mL,在培养箱中培养24h使细胞贴壁。
空白对照组加入培养基0.1mL,不同浓度的山慈菇提取物组以10、20、30mg/mL培养细胞24、48、72h后,吸弃各孔中培养液,每孔加入0.1mLMTT[含5%磷酸盐缓冲液(PBS)],在37℃下孵育4h后弃去上清,加入0.5%DMSO0.1mL,振荡摇匀,室温放置10min。
在0.1mLDMSO中发现蓝紫色的MTT甲臜沉淀物,使用ELISA法以酶标仪于490nm波长处测定OD值,计算细胞抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。
2.3流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期细胞,用0.25%胰酶消化并收集细胞,以RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL,接种于96孔培养板中,每孔0.1mL,移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。
以0(空白对照组)、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后,每孔悬浮细胞用PBS洗2次,加入500μlBindingBuffer和FITC标记的AnnexinⅤ(20μg/mL)10μl和碘化丙啶(PI,50μg/mL)5μl,避光反应15min,采用流式细胞仪定量检测,计算凋亡率。
2.4Westernblot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达取对数生长期细胞,用RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL,接种于6孔培养板中,每孔0.1mL,移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。
以0(空白对照组)、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后,用裂解液抽提。
根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白,将细胞的蛋白样品定量,变性;进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;转膜;脱脂牛奶封闭2h;洗膜,加入Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3(稀释倍数1∶1000)的一抗以及β-actin(稀释倍数1∶1000)作为阳性对照,4℃过夜;加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1h,然后洗膜、风干;ECL发光显影。
用凝胶图像分析系统进行数据分析。
2.5统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。
计量资料以(x±s)表示,多组间的比较用单因素方差分析,两组之间比较用LSD法进行统计。
P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1细胞抑制率的测定MTT结果显示,随着时间与药物干预浓度的增加,山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞生长增殖的抑制率逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.01),并且抑制作用呈时间、剂量依赖关系。
见表1。
3.2细胞凋亡率的测定与空白对照组比较,10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后,细胞出现明显凋亡,并且随着山慈菇提取物浓度的增加,凋亡细胞的比例逐渐增大,差异有统计学意义(P<0.01),并呈剂量依赖性。
见表2。
3.3Westernblot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的测定由图1可知,10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后,山慈菇提取物可使Cyt-C、Caspase-3、Bax蛋白表达增强,而Bcl-2蛋白表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖关系。
4讨论
细胞凋亡是基因介导的主动发生的程序性死亡,在正常情况下细胞凋亡与增殖维持动态平衡[5]。
细胞凋亡既可以出现在正常的生理过程中,也可以出现在多种疾病中,如肿瘤因关闭了线粒体的这一调控功能,使细胞凋亡减少出现细胞过度增殖现象[6]。
因此肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控相关,还与细胞凋亡密切相关[7],中间牵涉很多促凋亡和抗凋亡细胞因子。
随着对肿瘤细胞的凋亡和调控机制认识不断深入,选择性得抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的一个方向[8]。
实验采用MTT法证明山慈菇提取物能够抑制人结肠癌HT29细胞的生长,并且抑制作用随着剂量的增加、时间的延长而增强。
另外在细胞培养过程中,出现了大量的细胞凋亡,通过流式细胞仪检测的HT29细胞凋亡情况,结果表明,山慈菇提取物能够促进细胞凋亡,并且具有剂量依赖性。
凋亡是多基因严格控制的过程,包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。
而Caspase家族的凋亡途径包括两条:
①死亡受体介导的外源性途径(Fas-FasL);②线粒体介导的内源性调亡途径。
而Bcl-2家族成员又与线粒体介导的凋亡途径密切相关[9]。
研究表明:
细胞在外界以及DNA损伤等内部信号的刺激下将Bcl-2家族中的成员聚集在线粒体,在促凋亡与抑凋亡因子的作用下调节细胞色素C(Cyt-C)的释放,在胞浆中其与凋亡相关因子结合形成多聚体,激活Caspase-9,再激活其下游的Caspase-3,细胞发生凋亡[10-11]。
Bcl-2作为抑凋亡基因,在生长因子受体介导的信号传导途径中起作用,其通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发病。
而Bax则与其相反,它能促进细胞凋亡[12]。
若Bcl-2过表达,则与Bax形成异二聚体抑制细胞凋亡,若Bax过表达,则形成同源二聚体促进细胞凋亡[13]。
另外,研究提出Bcl-2/Bax比率关系细胞凋亡,当比率增大时,细胞凋亡受到抑制[14]。
本实验通过Western-blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3在人结肠癌HT29细胞中蛋白的表达,来研究山慈菇提取物对细胞凋亡的影响。
结果显示,山慈菇提取物通过提高Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达降低Bcl-2蛋白表达来诱导细胞凋亡。
综上所述,山慈菇提取物可以通过调节Cyt-C、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达来抑制结肠癌HT29细胞增殖,诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。
但本实验处于初步探讨阶段,仍需进一步加强山慈菇的实验研究,发掘山慈菇在肿瘤治疗中的作用。
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