微生物限度检查方案.docx
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微生物限度检查方案.docx
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微生物限度检查方案
五、验证程序
1.微生物限度检查方法操作环境要求
在质量控制部无菌实验系统洁净区进行,环境洁净度为10000级背景中的局部洁净度100级的单向流空气区域,实验前按《医药工业洁净室(区)悬浮离子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行过环境洁净度的验证,结果为合格。
2.计数培养基的适用性检查
2.1使用以下菌种(菌株的传代次数不超过5代)来制备菌悬液。
金黄色葡萄球菌[StaphyLococcusaureusCMCC(B)26003]
大肠埃希菌[EscherichiaaureusCMCC(B)44102]
枯草芽孢杆菌[BacillussubtilisCMCC(B)63501]
白色念珠菌[CandidalbicansCMCC(F)98001]
黑曲霉[AspergillusnigerCMCC(F)98003]
2.2菌液的的制备
2.2.1金黄色葡萄球菌:
接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中,30~35℃培养18~24小时,取培养物1ml,加入0.9%无菌氯化钠溶液9ml中,再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5,制成每1ml含菌数约为50~100cfu的菌悬液。
2.2.2大肠埃希菌:
接种大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中,30~35℃培养18~24小时,取培养物1ml,加入0.9%无菌氯化钠溶液9ml中,再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5,制成每1ml含菌数约为50~100cfu的菌悬液。
2.2.3枯草芽孢杆菌:
接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中,30~35℃培养18~24小时,取培养物1ml,加入0.9%无菌氯化钠溶液9ml中,再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5,制成每1ml含菌数约为50~100cfu的菌悬液。
2.2.4白色念珠菌:
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,23~28℃培养24~48小时,取培养物1ml,加入0.9%无菌氯化钠溶液9ml中,再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5,制成每1ml含菌数约为50~100cfu的菌悬液。
2.2.5黑曲霉:
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管中,取培养物1ml,加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml中,再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4,制成每1ml含菌数约为50~100cfu的菌悬液。
2.2.6以上菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可以在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。
2.3菌液计数
2.3.1分别取上面制备的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml加入培养皿,注入45℃营养琼脂培养基约18ml,每种菌悬液各制备2个平皿,置30~35℃培养48小时,取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。
2.3.2分别取上面制备的白色念珠菌菌悬液1ml、黑曲霉孢子菌悬液1ml,分别加入培养皿,注入45℃改良马丁琼脂培养基约18ml,每种菌悬液各制备2个平皿,置23~28℃培养72小时,取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。
2.4培养基适用性检查
2.4.1取50~100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌悬液,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂对照培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置30~35℃培养48小时,取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。
2.4.2取50~100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72小时,取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。
2.4.3同时取以上相应的对照培养基同2.4.1、2.4.2操作。
2.2.5结果判断
被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。
3.稀释液、冲洗液及其制备方法
3.10.9%氯化钠溶液的的制备
取氯化钠9g,加水1000ml溶解,分装,灭菌。
3.2采用验证合格的灭菌程序灭菌,即121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
4.供试品的取样
4.1供试品为该品种在符合GMP要求的车间正常生产的产品,生产过程符合GMP要求。
4.2随机抽取具代表性的样品,作为供试品。
5.微生物限度计数方法的验证
5.1菌种及菌液的制备:
同培养基适用性检查。
5.2供试液的制备
取供试品10g,加入无菌0.9%氯化钠溶液10ml溶解制成10-1混悬液,再10倍稀释至10-2及10-3,备用。
5.2平皿计数法验证
5.2.1试验组:
5.2.1.1取制备好的10-1稀释级的供试液1ml和以上金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌悬液1ml,分别注入平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,混均,凝固,每株试验菌平行制备2个平皿,测定其菌数。
5.2.1.2取制备好的10-1稀释级的供试液1ml和以上白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1ml,分别注入平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,混均,凝固,每株试验菌平行制备2个平皿,测定其菌数。
5.2.2菌液组
与试验组同法操作,只是不加入供试液,测定所加入的试验菌数。
5.2.3供试品对照组
5.2.3.1取制备好的10-1稀释级的供试液1ml,分别注入直径90cm的平皿中,立即倾注15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基,混均,凝固,每个稀释级别平行制备2个平皿,测定供试品本底菌数。
5.2.3.2取制备好的10-1稀释级的供试液1ml,分别注入平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,混均,凝固,每株试验菌平行制备2个平皿,测定供试品本底菌数。
5.2.4稀释剂对照组
与试验组同法操作,只是把供试液1ml换成分散剂(0.9%氯化钠无菌溶液)1ml,考察分散剂及分散过程对微生物的影响程度。
5.2.5培养:
营养琼脂培养基平皿在30~35℃培养3天,取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果;玫瑰红钠琼脂培养基平皿在23~28℃培养5天,取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。
5.2.6以上试验独立重复3次。
5.2.7结果判断
5.2.7.1在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
5.2.7.2在3次独立的平行试验中,试验组的菌数回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。
5.2.7.3若能同时满足5.2.7.1及5.2.7.2两项条件,则可以照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。
5.2.7.4若不能同时满足5.2.7.1及5.2.7.2两项条件,则应采采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
5.2.7.5若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染。
5.2.7.6在不影响检验结果判断的前提下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。
5.2.7.7计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收率最接接要求的主法和试验条件进行供试品的检验。
5.2.7.8验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
6.供试品的无菌检查(平皿法)
6.1供试品的检验用量
是指一次试验所用的供试品量(g)。
除另有规定外,一般供试品的检验量为10g,从2个以上最小包装单位中抽取供试品,一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包培装单位)的3倍供试品。
6.2供试品的制备
取供试品10g,加入无菌0.9%氯化钠溶液10ml溶解制成10-1混悬液,再10倍稀释至10-2及10-3,备用。
供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。
6.3供试品的检查
6.3.1取制备好的10-1、10-2、10-3稀释级的供试液1ml,分别注入直径90cm的平皿中,立即倾注15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基,混均,凝固,每个稀释级别平行制备2个平皿。
6.3.2取制备好的10-1、10-2、10-3稀释级的供试液1ml,分别注入直径90cm的平皿中,立即倾注15~20ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基,混均,凝固,每个稀释级别平行制备2个平皿。
6.3阴性对照
取无菌0.9%氯化钠溶液1ml,置无菌平皿中,分别倾注15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基,混均,凝固,每个稀释级别平行制备2个平皿,作为阴性对照。
6.4培养
6.4.1细菌在30~35℃培养3天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。
6.4.2霉菌和酵母菌在在23~28℃培养5天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。
6.5计数
6.5.1菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
6.5.2若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
6.5.3一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数。
6.5.4若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数,然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
6.6菌数报告规则
6.6.1细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。
以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g供试品中所含的菌数。
6.6.2如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
6.7结果判断
6.7.1当培养结束后,阴性对照平皿应无菌生长,否则,应判试验结果无效。
6.7.2每1g供试品中所含的细菌总数小于等于1000cfu,霉菌和酵母菌总数小于等于100cfu,判该供试品微生物限度检查符合规定;
6.7.3若供试品的细菌数大于1000cfu,或霉菌数和酵母菌数大于100cfu,应从同一批样品中随机抽样,独立复试两次,以3次结果的平均值报告菌数,每1g供试品中所含的细菌平均总数小于等于1000cfu,霉菌和酵母菌平均总数小于等于100cfu,判该供试品符合规定,否则,判为不符合规定。
六、合格标准
1、微生物限度检查方法操作环境符合要求。
2、培养基的适用性检查符合要求。
3、微生物限度检查计数方法验证试验符合要求。
4、各试验批次供试品的微生物限度检查结果符合要求。
以上四项结果均为符合要求时,方可判定建立的该微生物限度检查法适用于瑞舒伐他汀钙胶囊的微生物限度项目的检查。
七、验证结论
完成验证记录,验证检验结果符合限度标准,验证小组将记录进行整理并对结果进行分析评价,完成验证报告,提交验证委员会审批。
验证委员会负责对验证结果进行评价,发放验证合格证书。
八、验证周期
1.若药品的组分发生改变时,该检查方法应重新验证;
2.原检验条件发生改变时,该检查方法应重新验证;
3.产品的生产工艺发生了变更,该检查方法应重新验证。
附表
验证确认审核表
验证名称
项目主管意见
项目主管:
日 期:
年月日
验证小组意见
验证组长:
日 期:
年月日
备
注
附表
验证评价报告
验证名称
验证过程中存在的偏差及处理意见:
验证小组组长签字:
日期:
年月日
验证的结果意见:
验证小组组长签字:
日期:
年月日
最终结论:
验证小组组长签字:
日期:
年月日
备注
**药业有限公司编号:
**
微生物限度检查方法(平皿计数法)验证报告
验证产品名称
瑞舒伐他汀钙胶囊
规格
5mg
验证产品批号
091001
培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基
试验菌名称
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉
验证方案依据
《中国药典》2010年版附录ⅪJ----微生物限度检查法
验证日期
自2009年10月14日至2009年10月17日
验证方案(平皿法)
菌悬液的制备:
按要求制备好每1ml中含菌数为50~100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌悬液及每1ml中含孢子数为50~100cfu的黑曲霉孢子悬液,备用。
供试液的制备:
在规定的试验环境下,称取10g样品,加0.9%无菌氯化钠溶液100ml,混匀,制成稀释级别为1:
10的混悬液,再取出适量,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1:
100;1:
1000稀释级别的供试液,备用。
试验组:
取■1×10-1□1×10-2□1×10-3的供试液1ml和一种菌悬液1ml,置同一个平皿中,注入15ml溶化的营养琼脂培养基,混匀,凝固,每株试验菌以上法平行制备2个平皿,共制得10个平皿,其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌在30~35℃倒置培养48小时,白色念珠菌、黑曲霉在23~28℃倒置培养72小时,点计菌落数。
菌液组:
取以上一种菌悬液1ml,置一个平皿中,注入15ml溶化的营养琼脂培养基,混匀,凝固,每株试验菌以上法平行制备2个平皿,共制得10个平皿,其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌在30~35℃倒置培养48小时,白色念珠菌、黑曲霉在23~28℃倒置培养72小时,点计菌落数。
供试品对照组:
取3个稀释级别的供试液1ml,各注入15ml溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基,混匀,凝固,共制得6个平皿,其中营养琼脂培养基在30~35℃倒置培养48小时,玫瑰红钠琼脂培养基在23~28℃倒置培养72小时,点计菌落数,按菌落报告规则报告菌落数。
稀释剂对照组:
取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和一种菌悬液1ml,置同一个平皿中,注入15ml溶化的营养琼脂培养基,混匀,凝固,每株试验菌以上法平行制备2个平皿,共制得10个平皿,其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌在30~35℃倒置培养48小时,白色念珠菌、黑曲霉在23~28℃倒置培养72小时,点计菌落数。
稀释剂对照组菌回收率=稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%
试验组的菌回收率=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%
试验菌名称
稀释剂对照组菌回收率(应≥70%)
结果
试验组的菌回收率(应≥70%)
结果
第1次
第2次
第3次
第1次
第2次
第3次
金黄色葡萄球菌
95%
90%
91%
合格
89%
92%
83%
合格
大肠埃希菌
87%
98%
94%
合格
98%
91%
96%
合格
枯草芽孢杆菌
81%
90%
90%
合格
83%
87%
84%
合格
白色念珠菌
85%
87%
83%
合格
88%
81%
90%
合格
黑曲霉
86%
94%
96%
合格
93%
92%
89%
合格
验证过程
试验环境微生物监控结果
万级菌落数(CFU/碟)
百级菌落数(CFU/碟)
■合格□不合格
■合格□不合格
有可能引起微生物污染的因素
■无□有
验证结论:
■可以照此检查法进行本品的细菌、霉菌及酵母菌计数检查;
□应对检验方法进行重新验证。
负责人:
复核人:
验证人:
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