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2612新微生物限度检测
2.6.12.MICROBIOLOGICALEXAMINATIONOFNON-STERILEPRODUCTS:
MICROBIALENUMERATIONTESTS
2.6.12.非无菌药品的微生物检测:
微生物计数试验
1.INTRODUCTION导言
Thetestsdescribedhereafterwillallowquantitativeenumerationofmesophilicbacteriaandfungiwhichmaygrowunderaerobicconditions.
本试验用于检测在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌总数。
Thetestsaredesignedprimarilytodeterminewhetherasubstanceorpreparationcomplieswithanestablishedspecificationformicrobiologicalquality.Whenusedforsuchpurposesfollowtheinstructionsgivenbelow,includingthenumberofsamplestobetaken,andinterprettheresultsasstatedbelow.
本试验用于检测原料药或制剂是否符合已建立的微生物限度要求,基于这一目的应遵循以下指导原则,包括取样量并且按照下述方法分析试验结果。
Themethodsarenotapplicabletoproductscontainingviablemicro-organismsasactiveingredients.
此试验方法不适用于含有活性微生物的药品的检测。
Alternativemicrobiologicalprocedures,includingautomatedmethods,maybeused,providedthattheirequivalencetothePharmacopoeiamethodhasbeendemonstrated.
倘若已证明某种方法可产生与药典试验方法同样的效果,此方法也可应用,其中包括自动化方法。
2.GENERALPROCEDURES一般程序
Carryoutthedeterminationunderconditionsdesignedtoavoidextrinsicmicrobialcontaminationoftheproducttobeexamined.Theprecautionstakentoavoidcontaminationmustbesuchthattheydonotaffectanymicro-organismsthataretoberevealedinthetest.
试验应在供试品不被外来微生物污染的条件下进行,用于防止供试品污染的措施不应影响微生物的检出。
Iftheproducttobeexaminedhasantimicrobialactivity,thisisinsofaraspossibleremovedorneutralised.Ifinactivatorsareusedforthispurpose,theirefficacyandtheirabsenceoftoxicityformicro-organismsmustbedemonstrated.
如果被检测供试品有抗微生物活性,必须进行中和。
如果使用灭活剂来消除供试品的抗微生物活性,必须证明其有效性和不会对微生物产生毒性。
Ifsurface-activesubstancesareusedforsamplepreparation,theirabsenceoftoxicityfor
micro-organismsandtheircompatibilitywithinactivatorsusedmustbedemonstrated.
如果在供试品的制备过程中使用了表面活性剂,必须证明其不会对微生物产生毒性并且可与灭活剂兼容。
3.ENUMERATIONMETHODS计数方法
Usethemembranefiltrationmethodortheplate-countmethods,asprescribed.Themost-probable-number(MPN)methodisgenerallytheleastaccuratemethodformicrobialcounts,however,forcertainproductgroupswithaverylowbioburden,itmaybethemostappropriatemethod.
使用薄膜过滤法或平皿计数法进行计数。
最大可能数法通常测定的结果是不很准确,然而对于一些微生物生长极少的供试品,最大可能数法是一种比较适用的方法。
Thechoiceofmethodisbasedonfactorssuchasthenatureoftheproductandtherequiredlimitofmicro-organisms.Thechosenmethodmustallowtestingofasufficientsamplesizetojudgecompliancewiththespecification.Thesuitabilityofthemethodchosenmustbeestablished.
方法的选择基于供试品的性质和微生物限度的要求,使用选择的方法对足够量的供试品检测,测定其是否符合要求。
必须建立选择使用的方法的适应性。
4.GROWTHPROMOTIONTEST,SUITABILITYOFTHECOUNTINGMETHODANDNEGATIVECONTROLS
培养基的增菌作用试验,计数方法适应性试验,阴性对照试验
4-1GENERALCONSIDERATIONS总则
Theabilityofthetesttodetectmicro-organismsinthepresenceofproducttobetestedmustbeestablished.
该试验要有一定的检测微生物的能力。
Suitabilitymustbeconfirmedifachangeintestingperformance,ortheproduct,whichmayaffecttheoutcomeofthetestisintroduced.
如果产生影响试验结果的操作或被测物品发生变化,该试验的适应性必须证实。
4-2.PREPARATIONOFTESTSTRAINS试验用菌株的制备
Usestandardisedstablesuspensionsofteststrainsorpreparethemasstatedbelow.Seedlot
culturemaintenancetechniques(seed-lotsystems)areusedsothattheviablemicro-
organismsusedforinoculationarenotmorethan5passagesremovedfromtheoriginal
masterseed-lot.GroweachofthebacterialandfungalteststrainsseparatelyasdeacribedinTable2.6.12.-1.。
使用标准稳定的试验用菌株的菌悬液或按照以下方法制备,使用的种子批传代次数不得超过5代。
按照表2.6.12-1.制备细菌和真菌的试验用菌株。
Table2.6.12.-1.—Preparationanduseoftestmicro-organisms
试验用菌株的制备和使用
Micro-organism
微生物种类
Preparationofteststrian
试验用菌株的制备
Growthpromotion
增菌作用
Suitabilityofcountingmethodinthepresenceoftheproduct
计数方法的适应性
Totalaerobicmicrobialcount
总好氧菌数
Totalyeastsandmouldscount
酵母菌和霉菌总数
Totalaerobialmicrobialcount
总好氧菌数
Totalyeastsandmouldscount
酵母菌和霉菌总数
Staphylococcusaureussuchas:
ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276
金黄色葡萄球菌,如ATCC6538,NCIMB9518,CIP4.83,NBRC13276
Caseinsoyabeandigestagarorcaseinsoyabeandigestbroth30-35℃18-24h
干酪素大豆消化琼脂培养基或干酪素大豆消化肉汤培养基30-35℃条件下培养18-24小时
Caseinsoyabeandigestagarorcaseinsoyabeandigestbroth≤100CFU30-35℃≤3days
干酪素大豆消化琼脂培养基或干酪素大豆消化肉汤培养基
-
Caseinsoyabeandigestagar/MPNcaseinsoyabeandigestbroth≤100CFU30-35℃≤3days
干酪素大豆消化琼脂培养基/最大可能数法或干酪素大豆消化肉汤培养基
-
Pseudomonasaeruginosasuchas:
ATCC9027NCIMB8626CIP82.118NBRC13275
铜绿假单胞菌,如ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118,NBRC13275
Caseinsoyabeandigestagarorcaseinsoyabeandigestbroth30-35℃18-24h
干酪素大豆消化琼脂培养基或干酪素大豆消化肉汤培养基30-35℃条件下培养18-24小时
Caseinsoyabeandigestagarorcaseinsoyabeandigestbroth≤100CFU30-35℃≤3days
干酪素大豆消化琼脂培养基或干酪素大豆消化肉汤培养基
-
Caseinsoyabeandigestagar/MPNcaseinsoyabeandigestbroth≤100CFU30-35℃≤3days
干酪素大豆消化琼脂培养基/最大可能数法或干酪素大豆消化肉汤培养基
-
Bacillussubtilissuchas:
ATCC6633NCIMB8054CIP52.62NBRC3134
枯草芽孢杆菌,如ATCC6633,NCIMB8054,CIP52.62,NBRC3134
Caseinsoyabeandigestagarorcaseinsoyabeandigestbroth30-35℃18-24h
干酪素大豆消化琼脂培养基或干酪素大豆消化肉汤培养基30-35℃条件下培养18-24小时
Caseinsoyabeandigestagarorcaseinsoyabeandigestbroth≤100CFU30-35℃≤3days
干酪素大豆消化琼脂培养基或干酪素大豆消化肉汤培养基
-
Caseinsoyabeandigestagar/MPNcaseinsoyabeandigestbroth≤100CFU30-35℃≤3days
干酪素大豆消化琼脂培养基/最大可能数法或干酪素大豆消化肉汤培养基
-
Candidaalbicanssuchas:
ATCC10231NCPF3179IP48.72NBRC1594
白色念珠菌,如ATCC10231,NCPF3179,IP48.72,NBRC1594
Sabouraud-dextroseagarorSabouraud-dextrosebroth20-25℃2-3days
沙保氏-葡萄糖琼脂培养基或沙保氏-葡萄糖肉汤培养基20-25℃条件下培养2-3天
Caseinsoyabeandigestagar≤100CFU30-35℃≤5days
干酪素大豆消化琼脂培养基
Sabouraud-dextroseagar≤100CFU20-25℃≤5days
沙保氏-葡萄糖琼脂培养基
Caseinsoyabeandigestagar≤100CFU30-35℃≤5daysMPN:
notapplicable
干酪素大豆消化琼脂培养基
Sabouraud-dextroseagar≤100CFU20-25℃≤5days
沙保氏-葡萄糖琼脂培养基
Aspergillsnigersuchas:
ATCC16404IMI1431.83NBRC9455
黑曲霉菌,如ATCC16404,IMI1431.83,NBRC9455
Sabouraud-dextroseagarorpotato-dextroseagar20-25℃5-7days,oruntilgoodsporulationisachieved
沙保氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基20-25℃条件下培养5-7天或者培养到形成很好的孢子
Caseinsoyabeandigestagar≤100CFU30-35℃≤5days
干酪素大豆消化琼脂培养基
Sabouraud-dextroseagar≤100CFU20-25℃≤5days
沙保氏-葡萄糖琼脂培养基
Caseinsoyabeandigestagar≤100CFU30-35℃≤5daysMPN:
notapplicable
干酪素大豆消化琼脂培养基
Sabouraud-dextroseagar≤100CFU20-25℃≤5days
沙保氏-葡萄糖琼脂培养基
Usebufferedsodiumchloride-peptonesolutionpH7.0orphosphatebuffersolutionpH7.2tomaketestsuspensions;tosuspendA.nigerspores,0.05percentofpolysorbate80maybeaddedtothebuffer.Usethesuspensionswithin2horwithin24hifstoredat2-8℃.AsanalternativetopreparingandthendilutingafreshsuspensionofvegetablecellsofA.nigerorB.subtilis,astablesporesuspensionispreparedandthenanappropriatevolumeofthesporesuspensionmaybemaintainedat2-8℃foravalidatedperiodoftime.
使用pH为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液制备试验用菌悬液,对于黑曲霉孢子悬液需加入0.05%的吐温-80。
当菌悬液贮存在2-8℃条件下时,可在2小时或24小时内使用。
或者先制备新鲜的黑曲霉或枯草芽孢杆菌悬液再将其稀释,适宜量的稳定的孢子悬液贮存在2-8℃条件下用于验证。
4-3.NEGATIVECONTROL阴性对照试验
Toverifytestingconditions,anegativecontrolisperformedusingthechosendiluentinplace
ofthetestpreparation.Theremustbenogrowthofmicro-organisms.Anegativecontrolisalsoperformedwhentestingtheproductsasdescribedonsection5.Afailednegativecontrolrequiresaninvestigation.
为检测试验条件是否符合要求,取试验用稀释液代替供试品做一阴性对照试验,阴性对照试验应无微生物生长。
按照第五部分检测供试品时,也要做一阴性对照试验。
当阴性对照试验结果不符合要求时,要进行调查。
4-4.GROWTHPROMOTIONOFTHEMEDIA培养基的增菌作用
Testeachbatchofready-preparedmediumandeachbatchofmedium,preparedeitherfromdehydratedmediumorfromtheingredientsdescribed.
检测每一批培养基,这些培养基由脱水培养基或由规定的成分制得。
Inoculateportions/platesofcaseinsoyabeandigestbrothandcaseinsoyabeandigestagarwithasmallnumber(notmorethan100CFU)ofthemicro-organismsindicatedinTable2.6.12.-1,usingaseparateportion/plateofmediumforeach.InoculateplatesofSabouraud-dextroseagarwithasmallnumber(notmorethan100CFU)ofthemicro-organismsindicatedinTable2.6.12.-1,usingaseparateplateofmediumforeach.IncubateintheconditionsdescribedinTable2.6.12.-1.
将表2.6.12.-1.中的菌种(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌≤100CFU)分别接种于干酪素大豆消化肉汤和干酪素大豆消化琼脂培养基中,将表2.6.12.-1.中的菌种(白色念珠菌、黑曲霉菌≤100CFU)分别接种于沙保氏-葡萄糖琼脂培养基中,在表中规定的条件下培养。
Forsolidmedia,growthobtainedmustnotdifferbyafactorgreaterthan2fromthecalculatedvalueforastandardisedinoculum.Forafreshlypreparedinoculum,growthofthemicro-organismscomparabletothatpreviouslyobtainedwithapreviouslytestedandapprovedbatchofmediumoccurs.Liquidmediaaresuitableifclearlyvisiblegrowthofthemicro-organismscomparabletothatpreviouslyobtainedwithapreviouslytestedandapprovedbatchofmediumoccurs.
对于固体培养基,如果微生物的生长情况与已批准合格的培养基中微生物的生长情况类似,说明固体培养基符合要求;对于液体培养基,如果微生物的生长清晰可见并且与已批准合格的培养基中微生物的生长情况类似,说明液体培养基符合要求。
4-5.SUITABILITYOFTHECOUTINGMETHODINTHEPRESENCEOFPRODUCT计数方法的适应性
4-5-1.Preparationofthesample.Themethodforsamplepreparationdependsuponthephysicalcharacteristicsoftheproducttobetested.Ifnoneoftheproceduresdescribedbelowcanbedemonstratedtobesatisfactory,analternativeproceduremustbedeveloped.
样品的制备:
样品的制备方法依赖于供试品的物理性质。
如果对于某种供试品下述方法都不适合,应建立其他供选择的方法。
Water-solubleproducts.Dissolveordilute(usuallya1in10dilutionisprepared)theproducttobeexaminedinbufferedsodiumchloride-peptonesolutionpH7.0,phosphatebuffersolutionpH7.2orcaseinsoyabeandigestbroth.Ifnecessary,adjusttopH6-8.Furtherdilutions,wherenecessary,arepreparedwiththesamediluent.
水溶性供试品将供试品溶解或稀释于pH为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液或干酪素大豆消化肉汤中,制成1:
10的供试液。
如果需要可将供试液pH调节到6-8。
当需要进一步稀释时,可用同样的稀释液将供试液稀释。
Non-fattyproductsinsolubleinwater.Suspendtheproducttobeexamined(ususllya1in10dilutionisprepared
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