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各生理指标的测定方法
各生理指标的测定方法
一、脯氨酸含量的测定
1.苗三酮法
1.1原理
在正常坏境条件卞,植物体内游离脯氨酸含量较低,但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时,植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游离脯氨酸枳累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。
用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性苗三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
1.2步骤
试剂:
(1)25%苗三酮:
帝三酮0.625g
冰乙酸15ml
6mol/L磷酸10ml
70°C水浴助溶;
(2)6mol/L磷酸:
85%磷酸棉释至原体积的2.3倍;
(3)3%磺基水杨酸:
磺基水杨酸3g
加蒸饰水至100ml
实验步骤:
(1)称取0.1名样品放入研钵,加5ml3%磺基水杨酸研磨成匀浆,100°C沸水浴15min;
(2)冰上冷却,4000rpm离心lOmin:
(3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%苗三酮2ml混合均匀,100°C沸水浴30min,冰上冷却;
(4)加4ml甲苯混合均匀,震荡30s,静置30min;
(5)以甲苯为空白对照,再520nm下测定吸光值。
1.3计算方法
脯氨酸含量(Ug/gFW)=X*提取液总量(ml)/
样品鲜重(G*测定时提取液用量(ml)*10飞
公式中:
X——从标准曲线中查得的脯氨酸含量(Pg)
提取液总量5ml
测定时提取液用量2ml
问题及质疑:
1.酸性体系下,脯氨酸与苗三酮加热反应后的最终产物为红色,再实验过程中,仅有少数时候能发现红色产物。
原因有待确定。
2.经查看文献资料,反应步骤已经是优化的,没有问题。
甲苯萃取脯氨酸与苗三酮的反应产物,消除了多余未反应的苗三酮,磺基水杨酸,提取液中其他杂质(如色素)以及PH变化
的干扰。
3•根据苗三酮与脯氨酸的缩合反应分析:
(1)反应体系的PH控制很重要,保持酸性环境,否则,反应产物的最人吸光值并不在520nmo
(2)极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大,材料干重比新鲜材料多数倍,加相同量的苗三酮,反应程度应该有所不同。
而脯氨酸含量少的样本,容易受到各种因素的干扰。
二、丙二醒含量的测走
1.原理
植物在逆境卞遭受伤害(或衰老)与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关,膜脂过氧化的产物有二烯轨合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。
其中丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一,因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度,以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
辺三甲基恶哇2、4・二酮(三甲川),该物质在532nm处有一吸收高峰,并且在
660nm处有较小光吸收。
由于醛、可溶性糖对此反应有干扰,在450nm处有一吸收峰,用双组分分光光度法加以排除。
2.步骤
试剂:
(1)10%三氯乙酸(TCA):
TCA25g
加ddH:
0至250ml
(2)0.6%硫代巴比妥(TEA):
TBA0.6g
加5%TCA至100ml
实验步骤:
(1)称取材料0.1“加10%TCA2nil研磨至匀浆,再加8ml进一步研磨;
(2)dOOOrpm离心lOmin,取上清至新管;
(3)2nd提取液+2ml0.6%TEA,混合均匀,2mlddH:
0+2ml0.6%TBA为空白对昭・
八X・
(4)混合沸水浴15min,冰上冷却;
(5)4000rpm离心lOmin;
(6)取上清再532nm,600nm»450nm波长卜的光密度值。
3.计算方法
•才聊=[6.452x(%-D諒-05妙%卞令
式中,Vt:
提取液总体积(mL)10ml;
Vs:
测定用提取液体积(ml)2ml;
FW:
样品鲜重(g)0.Igo
注意事项:
1.可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收(最人吸收在450nm),当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高,必要时要排除可溶性糖的干扰。
2.低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应,当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+(最终浓度为0.5nmol・LT)
3.如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机离心。
三、过氧化氢酶的活性测定一一高猛酸钾滴定法
【原理】
过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H^O2=R(Fe+3+OH
2e
R(Fe^OH)+H2O2=R(Fe+》+2H9+Oj
据此,可根据HO,的消耗量或6的生成量测定该酶活力人小。
在反应系统中加入一定量(反应过量)的HQ:
溶液,经酶促反应后,用标准高鎰酸钾溶液(在酸性条件卞)滴定多余的H9?
5H2O2+2KMiiO4+4H2SO4—>5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
即可求出消耗的的量。
【仪器和用具】
研钵;三角瓶50nilX4;酸式滴定管(lOnil);恒温水浴;容量瓶25nilXlo
【试剂】
10%H2SO4:
0.2moLL磷酸缓冲液pH7.8:
O.lmoLT高猛酸钾标准液:
称取KMiiO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馆水配制成1000ml,用0.1moL'L草酸溶液标定;
O.lmoVLHzO:
:
市售30%良Ch大约等于17・6niolL取30%HzCh溶液5・68ml,桶释至10001111,用标准0.1mol/KMiiO4溶液(在酸性条件下)进行标定;
O.lmoVL草酸:
称取优级纯H2C2O4•2H:
O12.607g,用蒸馆水溶解后,定容至1L。
【方法】
1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25nil容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000ipm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个(两个测定两个对照),测定瓶中加入酶液2.5ml,对照瓶中加入煮死酶液2.5ml,再加入2.51111O.lmoL'LH2O2,同时计时,于30°C恒温水浴中保温lOnun,立即加入10%H2SO42.5ml。
3.用O.lmol/LKMnO^标准溶液滴定HQ?
至出现粉红色(在30mm内不消失)为终点。
4.结果计算:
酶活性用每克鲜重样品1mm内分解H2O,的亳克数表示:
(A-B)xVtx1.7
酶活(mgH2O2/gFW•nun)=HVxVixt
式中A—对照KMnO」滴定亳升数;
E—酶反应后KMnOq滴定亳升数;
Vt—酶液总量(ml):
V]—反应所用酶液量(ml);
W—样品鲜重(g);
1.7—lnil0.1mol/L的KMnCh相当于1.7mgH92。
【注意】
所用KMiiO4溶液及HQ訂容液临用前要经过重新标定。
四、植物叶绿素含量的测定(分光光度法)
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯一比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比,即八=aCL式中:
a比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为lcm时,a为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定己知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
高等植物中叶绿素有两种:
叶绿素a和b,两者均易溶于乙醇、乙醍、丙酮和氯仿。
叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小,比值高则大,比值小则反之。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料:
新鲜(或烘干)的植物叶片。
(二)仪器设备:
1)分光光度计;2)电子顶载天平(感量O.Olg);3)研钵;
4)棕色容量瓶;5)小漏斗;6)定量滤纸;7)吸水纸;8)擦境纸;9)滴管。
(三)试剂:
1)95%乙醇(或80%丙酮);2)石英砂;3)碳酸钙粉。
三、实验步骤
(1)取新鲜植物叶片(或其它绿色组织),擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。
(2)称取剪碎的新鲜样品0.2g,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2〜3ml95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。
静置3〜omino
(3)取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25沁棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
(4)用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25ml,摇匀。
(5)把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内,以95%乙醇为空白,在波长663nm和645nm下测定吸光度。
四、(4)95%乙醇为空白对照,在645nm、663nm、652nm波长下测定光密度值。
1.3计算方法
D663二82.O4Ca+9.27Cb
Dei5=16.75Ca+45.6Cb(浓度单位:
g/mL)
CA=12.72D663-2.59D615
CB二22.88D615-4.68D663
CT=20.29D615+8.02D663(浓度单位:
mg/L)
Chi(mg/g叶)二C(mg/L)*提取液总量(L)*稀释倍数/FW(g)
注意事项:
(1)避光。
(2)时间控制,研磨以及放置时间不宜过长。
(3)叶绿素一定要提干净,以免造成误差。
叶绿素a、b的总含量=8.02x0D663+20.20x0D645
注意:
1•叶绿素一定要提干净,避免造成测定误差
2.叶绿素初提液体积不要太多,以免浪费试剂,如果浓度太高可进行适当稀
六、
一【原理】
几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强。
主要是6淀粉酶和P•淀粉酶。
种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长。
e淀粉酶随机水解淀粉的a-1,4-糖昔键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用;其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖;卩•淀粉酶水解非还原端的第二个a-1,4-糖昔键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化。
两种淀粉酶具有不同理化特性,a•淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;“淀粉酶不耐热,在70°C下15min则被钝化。
据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化A淀粉酶测出*淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出淀粉酶活力。
淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5■二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3■氨基・5•硝基水杨酸。
在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
二【仪器与用具】
分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;具塞刻度试管(25ml13);吸管(1ml,2ml,5ml各1支);容量瓶(50ml2)。
三【试剂】
1)麦芽糖标准液(1mg/ml):
称取100mg麦芽糖,用蒸镭水溶解并定容至100ml;
2)3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):
精确称取3,5■二硝基水杨酸1g,溶于20ml2mol/LNaOH溶液中,加入50ml蒸镭水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸饰水定容至100mlo盖紧瓶塞,勿使CO2进入。
若溶液混浊可过滤后使用;
3)0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液:
配制方法如下:
A液(0.1mol/L柠檬酸)一称取分析纯柠檬酸21.01g,用蒸镉水溶解并定容至亿;
B液(O.1mol/L柠檬酸钠)一称取柠檬酸钠29.41g用蒸饰水溶解并定容至1L;取A液55ml与B液145ml混匀,即为0.1molILpH5.6的柠檬酸缓冲液;
4)1%淀粉溶液:
称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。
以下按论文顺序:
1材料
1.1材料取自大润发超市
1.2方法
1.2.1材料处理
发芽处理时,称取干种子40克,放在烧杯里用水浸润2小时以上,浸好后放在垫有纱布的培养皿上,种子上面再放浸湿的一层纱布,盖好,放在30度的培养箱里培养。
每培养一天,要对种子及纱布进行水投处理。
1.2.2标准曲线测定取试管7个编号,分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0.0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml,然后加蒸镉水使各管都达到2.0ml。
再各加入3,5■二硝基水杨酸2.0ml,置沸水浴中5min,冷却后再用蒸镉水稀释至25ml,即再加蒸馆水21mL在520nm处测其吸光值(A)。
以麦芽糖浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标作曲线,即为麦芽糖的标准曲线。
1.2.3样品的测定
1.2.3.1酶液的提取称取1g样品研磨成匀浆,取10ml蒸镉水用以研磨和洗涮研钵,移入离心管后在室温下放置15〜20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。
在3000rpm转速下离心5min,取上清液倒入50ml容量瓶中,加蒸镉水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液5ml,放入50ml容量瓶中,用蒸饰水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液。
1.2.3.2淀粉酶活性的测定取4支试管编号,先取2支,测定e淀粉酶活性,于每管中各加入酶提取液1.0mlo各管在70度恒温水浴中预热15mino取出迅速冷却。
再取另2支,测定总淀粉酶活性,于每管中各加入酶稀释液I.OmL在四个试管中均加入1.0mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
并均置40度恒温水浴15min,再分别在各管中加入40度预热的淀粉溶液2.0ml,混匀,立即放入40度水浴中保温15min,以促进酶促反应,再向各管中迅速加入4.0ml0.4mol/LNaOH,以终止酶的活性,然后准备测定。
(为便于操作可参考下列表1)
再取各管的处理溶液2.0ml,放入25ml试管中,再加入2.0ml3,5■二硝基水杨酸试剂,混匀。
置沸水浴中5min,冷却后再用蒸饰水稀释至25mlo在520nm处测其吸光值(A)。
并将1和2管,3和4管计算平均值。
然后由此平均数值从标准曲线中查出相应的麦芽糖含量(mg)。
123.3计算
1)a■淀粉酶活性(麦芽糖mg/g鲜重5min)■淀粉酶麦芽糖含量样品稀释体积/样品重(g)显色时所用酶液体积
2)总淀粉酶活性(麦芽糖mg/g鲜重5min)二总淀粉酶麦芽糖含量样液稀释体积/样品重(g)显色时所用酶液体积
附:
样液稀液体积(a-淀粉酶为50ml,总淀粉酶为500ml);样品重为1克。
显色时所用酶液体积25ml
附表仁淀粉酶测定操作步骤表
表1淀粉酶测定操作步骤表
a■淀粉酶活性
总淀粉酶活性
试管编号
1
2
3
4
酶提取液ml
1
.0
1.0
淀粉酶稀释液ml
■■
■■
1.0
1.0
70度恒温水浴中
预热15min,取出迅速
■■
■■
冷却。
PH5.6的柠檬酸缓
冲液ml
1
.0
1.0
1.0
1.0
置40度恒温水浴15min
40度预热的淀粉溶
液ml
2
.0
2.0
2.0
2.0
再置40度恒温水浴15min,
0.4mol/LNaOH溶液ml
4
.0
4.0
4.0
4.0
附表2:
标准曲线测定数据记录表
表2.1标准曲线测定数据记录表
附表3、4、5:
三次样品测定数据记录及计算用表
表2.2第一次样品测定数据记录表
e淀粉酶
总淀粉酶
试管编号
1
2
3
4
吸光值
II
II
平均值
查标准曲线得麦芽糖浓度,或用方程计算
据公式算出酶活性(麦芽糖mg/g鲜重5min)
6淀粉酶酶活二
总淀粉酶酶活二
表2.3第二次样品测定数据记录表
a•淀粉酶
总淀粉酶
试管编号
1
2
3
4
吸光值
平均值
查标准曲线得麦芽糖浓度
据公式算出酶活(麦芽糖mg/g鲜重5min)
6淀粉酶酶活二
总淀粉酶酶活二
表2.4第三次样品测定数据记录表
总淀粉酶
a•淀粉酶
试管编号
「11
2
3
4
吸光值
平均值
查标准曲线得麦芽糖浓度
据公式算出酶活(麦芽糖mg/g鲜重5min)
6淀粉酶酶活二
总淀粉酶酶活二
七、可溶性糖含量的测走
1.蔥酮法
1.1原理
糖在浓硫酸作用卜•,可经脱水反应生成糠醛或疑甲基糠醛,生成的糠醛或起甲基糠醛町
与蔥酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在可见光吸收峰位620nmo
测定对彖:
几乎可以测定所有的碳水化合物,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(反应液中的浓硫酸町以把多糖水解成单糖而发生反应,所以用蔥酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量)。
1.2步骤
试剂:
(1)浓硫酸;
(2)蔥酮乙酸乙酯试剂:
蔥酮lg
加乙酸乙酯至——50ml
实验步骤:
(1)称取样品0.lg,置于研钵中,加4mlddH:
0研磨成匀浆,8mlddHzO洗涤研钵。
(2)100°C沸水浴lOmin,冰上冷却。
(3)4000rpm离心lOmin。
(4)取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。
(5)lml提取液+lmlddH:
O+O.5ml蔥酮+5ml浓硫酸,轻轻混合均匀,100°C沸水浴lOmin,冰上冷却。
(6)620nm处测吸光值。
1.3计算方法
可溶性糖含屋%二C*V/(W*10"6)*100%
V为植物样品桶释后的体枳(ml)100ml
C为提取液的含糖量(Ug/ml)根据标准曲线计算
W为植物组织鲜重量(g)0.lg
问题及质疑:
1.目标糖含量:
标准曲线是用葡萄糖位标准制作的,而蔥酮法是测总糖的量,包括己糖、戊糖,浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖,将总糖得出的0D值代入由单一糖做出的标准曲线,有一定误差存在。
注:
查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。
2.误差分析:
(1)不同糖类与蔥酮试剂反应的显色程度不同。
果糖最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖最浅造成误差。
(2)蔥酮试剂溶解度较低,非常容易析出,在反应时加入糖的水溶液中,出现浑浊现彖,影响反应进行。
(3)介于以上原因,将上清5ml转移至100ml容量瓶定容,稀释程度过人,当糖含量少的时候,大的误差可能会掩盖真实的糖含量。
造成品数据没有实际意义。
方案修改意见:
1.首先,做五到六组空白,测试分光光度计误差程度。
2.增加平行组数,由三组増加至五组,减少每个样品测试次数。
改变测试样品定容量,由100ml变为50ml。
八.植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质人多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力人小及酶制剂纯度。
因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。
本实验将分别介绍这两种方法。
一、考马斯亮蓝法
【原理】
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最人光吸收在465nm,后者在595mno在一定蛋白质浓度范围内(0〜100ug/nil),蛋白质一色素结合物在595mn波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。
故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2mm左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下lh内保持稳定。
该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。
【仪器与用具】
分光光度计,10ml量筒1支:
研体;10ml容量瓶1支;1ml刻度吸管3支;10ml具塞刻度试管14支。
【试剂】
(1)牛血清白蛋白配成1000ug/nil和100ug/ml:
(2)考马斯亮蓝G-250:
称取lOOmg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸1001111,最后用蒸馆I水定容至lOOOnilo此溶液在常温下可放置一个月;
(3)90%乙醇;(4)磷酸(85%,W/V)。
【方法】
1.标准曲线的绘制
(1)0-100ng/ml标准曲线的制作取6支试管,按表28-1数据配制0-100ug/nil血清白蛋白液各lml。
准确吸取所配各管溶液O.lnil,分别放入10ml具塞试管中,加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2min后,在595mnF比色,绘制标准曲线。
表28-1配制0〜100ug/ml血淸白蛋白液
管号
1
2
3
4
5
6
100ug/ml牛血清蛋白虽(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸憎水虽(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白质含蚩:
(mg)
0
0.02
0.04
0.06
0.0S
0.10
(2)0〜1000ug/ml标准曲线的制作另取6支试管,按表28-2数据配制0〜1000Ug/ml牛血清白蛋白溶液各lml。
与步骤
(1)操作相同,绘出0〜1000ug/ml的标准曲线。
表28-2配制0〜1000u0ml血清蛋白血液
管号
7
S
9
10
11
12
1000ugiiil牛血清白蛋白(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
炭馅水虽(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白质含虽(mg)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
2•样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml(样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5ml
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- 生理 指标 测定 方法