毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选.docx
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
菌体的准备:
1. 挑取酵母单菌落,接种至含有5mlYPD 培养基的50ml三角瓶中,30℃、250-300r/min培养过夜;
2. 取100-500µl (≤1:
100)的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中,28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h),至OD600 达到1.3~1.5;
3. 将细胞培养物于4℃,1500g离心5min,用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
4. 按步骤3离心,用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬
5. 按步骤3离心,用2-5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;
6.按步骤3离心,用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为240ul;
备注:
可将其分装为80µl一份的包装-70冷冻起来,2周之内使用,但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后,转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的
✓对于LOX家族蛋白的表达,可尝试在酵母培养基中加入Cu2+离子,提高表达量和蛋白活性?
菌种保存:
挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:
1加入30%灭菌甘油, -80oC ul/管冻存
(一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,约20ulddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit,回收的DNA可能还有盐,导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下:
1)酶切体系(80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2NaAC,混匀ﻫ2)-20℃20分钟沉淀ﻫ3)13200rpm,20min,离心后弃上清ﻫ4)75%乙醇300ul轻轻洗,同上离心5min,弃上清
5)37度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹)。
ﻫ6)20ul ddH2O重溶)
电击转化:
8. 将5~20µg的线性化DNA 溶解在5~10µ l TE溶液中,与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中;
9.将电转化杯冰浴5min;
10.根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及多次摸索,确定合适的电压、电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击;
11.电击完毕后,马上加入1ml1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml 的EP管中;(置于30度摇床低速培养1h,再涂板)
12. 将菌体悬液涂布于MD平板上,每200~600µ l 涂布一块平板;
13. 将平板置于30℃倒置培养,直至单个菌落出现(3-4天)。
推荐:
电压1.5kV;电容25µF;电阻200Ω。
电击时间为4 ~10msec。
Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
1.平板上的菌落长到肉眼可见时(约12小时);
2.取1ml酵母悬液4000rmp离心,pbs重悬,煮沸5mins,放到冰上5mins,直接就可以用做pcr的模板了
3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好,并分装。
3.用灭菌的牙签挑取菌落,在PCR管中涮一下,PCR扩增,
利用5’AOX1和3’AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组,则会扩增到两条带,一条为2.2kb(KM71为3.6kb)宿主茵AOXI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。
)
Each 50µlaliquotof competentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwill yield 50coloniesonselectivemedium.
Muts表型重组酵母的诱导表达实验
Asageneralrulewheninducingexpression,never allowcultures tobemorethan10-30%of yourtotalflask volume.
1.挑选一单菌落,置于装有50ml MGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中,于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h);
2.室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用1/5到1/10原培养体积的MM, BMM或BMMY重悬菌体(约2.5~5ml);
3. 将步骤2 所得的菌液置于100ml的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30°
C/250-300rpm 的摇床上继续生长;
4. 每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5~1.0%;
5.按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5mlEP 管中,最大转速离心2~3min ,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
时间点一般取:
0、24、48、72、96和120h;
6. 对分泌表达,分离样品的上清液;对胞内表达,分离样品的菌体沉淀,带检测样品用液
氮或干冰速冻后,于-80°C保存备用;
7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
Mut+表型重组酵母的诱导表达实验
1. 挑选一单菌落,置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中,于28-30°C/250-300rpm培养至OD600 =2-6(~16-18 h);
2. 室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用MM、BMM或BMMY重悬菌体,使OD600 =1.0左右(约100~200ml);
3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长;
4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5~1.0%;
5.按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5ml EP管中,最大转速离心2~3min,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
时间点一般取:
0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;
6.对分泌表达,分离样品的上清液;对胞内表达,分离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于-80°C保存备用;
7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
BMGY和BMMY的换液方式有2种:
1)一种是离心换液,即在生长培养结束后,转移到灭菌大离心管中,4000rpm室温离心5分钟后,用BMMY洗下菌体,再转移到摇瓶,整个过程均用灭菌移液管操作。
2)另一种是静止换液,即在生长培养结束后,将摇瓶在无菌室静止4小时后,直接在酒精灯旁倾倒培养液,再加入诱导培养基,此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液,到底那个好,只有根据自己的实验结果来考量。
如果只是从防治污染的角度来说,静止换液也好一些,因为操作毕竟少一些,速度也快。
用新开启的分析纯甲醇,一直放在无菌室里面,每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。
也有人试过用膜过滤,结果膜都溶解了。
菌体是在BMMY中培养的,可以不用BMMY做对照,在600nm处测OD值,培养基和PBS光吸收都很低,PBS更方便。
麦芽浸提液培养酵母(不换液,补料),生长阶段结束后,密度可达到10-12,诱导培养结束后,密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY,在生长阶段结束后,换液时,加入1/10-1/2体积的BMMY进行诱导培养(即浓缩培养),细胞密度也可达到20以上。
通常,真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现,OD600可达到40-60及以上。
摇瓶很难达到那样的密度,不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量,但可以通过装量来暂时替代这个指标。
Mut+/Muts的筛选
用SacI,SalIorStuI 线性化插入HIS4 位点的载体转化GS155后,多数转化子应为Mut+,但也有His+Muts的转化子存在(见Invitrogenprotocol p36),NotIorBglII线性化插入AOX I位点的载体转化GS155后,用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。
Usetheplatescontaining theHis+ transformantsand screenforthe Mut+andMutSphenotypeasdescribedbelow.
1. Usingasteriletoothpick,pickone colonyand streak orpatchoneHis+transformant in aregular pattern onbothanMMplate andanMDplate,makingsureto patch theMM platefirst.
2.Use anewtoothpickforeach transformantandcontinue until100transformantshave beenpatched(2-3plates).
3.To differentiateMut+from MutS, makeonepatchforeachofthecontrols(GS115/His+MutSAlbumin andGS115/His+ Mut+ β-gal)onto theMD andMMplates.
4.Incubatetheplates at 30°Cfor 2 days.
5.After2daysorlongerat30°C,scoretheplates.Mut+transformantswill growwellonbothMDandMMplates. MutS transformantswillgrowwellonMDplates,butshowlittleor nogrowth ontheMMplates.
We recommend purifyingyour His+ transformantstoensureisolationofapureclonalisolates.Youmaydo thisbeforeoraftertestingfor theMutphenotype.
Replica-PlatingProcedure
Thisproceduregivesalowerrate of misclassifications, but itincreasestheoverallMut+/MutSscreeningprocedure by2 days.Youwill needequipmenttoreplica-plate.
1.Usingsterile toothpicks, patch 100His+transformantonMDplates(2-3 plates).For controls, makeonepatchfromeachof thestrainsGS115/His+MutS Albumin andGS115/His+Mut+β-galonto theMDplates.
2. Incubatetheplatesat28-30°C for2 days.
3. After2 days, replica-platethepatchesfrom the MD plates ontofresh MMandMDplatestoscreenfor MutStransformants.
4.Incubatethereplica platesat28-30°Cfor2days.
5. After 2days at28-30°C,scorethereplicaplates.Look forpatchesthatgrownormallyontheMDreplicaplatesbutshowlittleornogrowthon theMMreplicaplates. IncludingHis+Mut+andHis+MutScontrolpatchesoneachplate willprovide examplesofMut+and MutSphenotypes.
ScreeningbyFunctionalAssay
Someresearchershaveuseda functionalassay todirectlyscreenforhighexpressing Pichiarecombinantclones withoutfirstscreeningforMutS orMut+phenotypes. Ifyouelectto screendirectly forhigh-expressingrecombinants,be sureto also checktheMutphenotype.Thiswillhelpyouoptimizeexpression ofyourrecombinantclone.
毕赤酵母基因组提取方法
⑴接种重组和空质粒转化子于5ml YPD+k抗生素培养基,GS115菌于YPD培养基作对照,30℃,培养16~18小时。
⑵室温下,1500g离心5-10min收集菌体
⑶100ul TE(pH7.0)重悬,加入300 ulEDTA(pH8.0),0.07MTris-HCl,3ulβ-巯基乙醇,1ulLyticase,37℃水浴30min。
⑷ 10000g离心5~10min,取沉淀,加90ul TE重悬。
⑸200ul 饱和酚,200ul氯仿,混匀,离心30s ,取上层水相。
⑹加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC,-20℃放置30min;
⑺10000g离心20min,弃上清;75%乙醇漂洗沉淀一次;
⑻干燥后,加入15μl的TE或H2O溶解,-20℃备用。
重组菌株传代次数太多,确实可能存在菌株退化的现象。
所以一定要保存好最原始的重组菌株,每次从中划板,挑单克隆表达,尽量减少菌株传代次数。
不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。
Pichia菌落PCR破壁方法(史飞):
30ul培养液,0.2%SDS
Votex15sec
离心1min
取上清,稀释5-10倍
用于PCR模板
GS115的鉴定方法
接种GS115于5mlYPD液体培养基,30℃,200rpm振荡过夜,涂布 YPD平板,30℃培养48小时,用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化,挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板,4℃保存。
GS115的his4基因突变了,不能在组胺酸缺陷型培养基上生长,一般的YPD培养基营养丰富,什么都有了,而YNB却只含基本氮源,GS115应该在上面不长,就是从YPD上挑菌落,在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下,在HIS上长而YNB上不长的是GS115,这样能挑到纯的,以防突变
毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基)4℃保存。
34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g硫酸铵,溶于1000ml水中,过滤除菌,或134gYNB固体溶于1L蒸馏水,过虑除菌or115℃15-20min灭菌。
注意毕赤酵母在高浓度YNB 下生长更好,所用 YNB 的量是酿酒酵母中的两倍。
500*B(0.02%生物素Biotin)20mg的生物素溶于100ml水中,水浴加热溶解,温度不能高于50度。
过滤除菌。
4℃保存保存期为1 年。
D-生物素是具有生物活性的生物素,也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中,作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加,因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素,但是做高密度发酵还是必须要添加的。
MD、MM属于基础培养基,没有哪种成分会含有微量生长因子(如生物素),所以肯定要加的。
100*H(0.4%Histidine 组氨酸) 4℃保存保存期为1年。
400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,(加热至50℃以促进溶解),过滤除菌。
10*D(20%Dextrose葡萄糖)保存期为1年。
200g 葡萄糖溶于1000ml水中,115℃灭菌15-20min或过滤除菌。
10*M(5%Methanol 甲醇)保存期为2个月。
将5ml的甲醇与95ml水混匀,过滤除菌。
10*GY(10%Glycerol甘油)保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml 水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。
100*AA(0.5% ofeach AminoAcid,各种氨基酸)4℃保存保存期为1年。
分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液(potassiumphosphatebuffer,pH6.0),将1mol/L的K 2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀,其pH为6.0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1M 山梨醇
毕赤酵母表达的培养基配制
2.1LB(Luria-Bertani)培养基:
Trypton l%
Yeast Extract 0.5%
NaCl l%
PH7.0 制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
2.2 LLB(LowSalt LB)培养基:
Trypton l%
YeastExtract 0.5%
NaCl 0.5%
PH 7.0制作平板时加入 2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
2.3 YPD完全培养基(又称YEPD)( Yeast ExtractPeptoneDextroseMedium,酵母浸出粉/ 胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)
Yeastextract 1% 10g/L
Trypton 2% 20g/L
dextrose (Dglucose)2% 20g/L
+agar 2%20g/L
液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
YPD或YEPD:
YeastExtract PeptoneDextroseMedium(1L),又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基,加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基.
YPD培养基配制方法:
1.溶解10gYeast Extract(酵母膏),20gPeptone(蛋白胨)于900ml水中,如制平板加20g琼脂粉
2.高压121度20min
3.加入100ml20%(10X,共20g)的Dextrose(glucose)(葡萄糖),(葡糖糖溶液灭菌后加入)
注:
葡萄糖,yeast extract,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应,导致培养基成分变化,所以要分别灭菌后再混合。
葡萄糖可以过滤除菌,也可以115℃15-20min灭菌。
YPD培养基用途:
用于酵母菌的培养,及供药品和生物制品含王浆和蜂蜜的合剂酵母菌数测定。
YPEG:
除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外,其他成分同YPD;YPDZ是在YPD的基础上加上ZEOCIN抗生素;YPDA是在YPD的基础上加0.003%的腺嘌呤硫酸盐。
2.4MD与MDH选择培养基
MinimalDextroseMedium+ (Histidine )最小葡萄糖培养基+(0.004 %组氨酸)(含有:
1.34%YNB;;4X10-5%生物素;2%葡萄糖)
1.灭菌800ml 的ddwater,冷却到60℃左右,加入
2ml的500*B,
100ml的10*YNB
100ml的10*D母液,4 ℃保存
2.如配制MDH,可在上述的MD中加入10ml的100*H 即可,4 ℃保存;
3. 如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15g的琼脂。
4℃可保存数月。
2.5MM和MMH培养基
MinimalMethanolMedium +(Histidine )(含有:
1.34%YNB;4X10-5%生物素;0.5%甲醇)
1.灭菌800ml的ddwater,冷却到60℃左右,加入
2ml 的500*B,
100ml的10*YNB
100ml的10*M,4 ℃保存
2. 如配制MMH,可在上述的MM中加入10ml的100*H即可,4℃保存;
3.如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15g的琼脂。
4℃可保存数月。
MMorMD是筛选mutS和mut+表型的。
2.6BMG和BMM培养基
BufferedMinimal Glycerol,BufferedMinimalMethanol (含有100mMpotassiumphosphatepH6.0, 1.34%YNB;4X10-5%生物素1% glycerol or0.5%methanol)
1.灭菌700ml的ddwater,冷却到室温,加入
2ml 的500*B,
100ml的10*YNB
100 ml的1Mpotassium phosphatebuffer
100ml的10*GY,4 ℃保存
2.如配制MMH ,可在上述的BMG中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可,4℃保存,可保存2个月。
2.7 BMGY 和BMMY
Buffered Glycerol complex Medium,BufferedMethanolcomplexMedium(含有1%yeast extract,2% peptone,100mMpotassiumphospha
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