DNA修复蛋白Ku80在人食管癌发生发展中的作用分析.docx

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DNA修复蛋白Ku80在人食管癌发生发展中的作用分析

DNA修复蛋白Ku80在人食管癌发生发展中的作用分析

中国医学科学院北京协和医学院（清华大学医学部）博士研究生毕业论文

缩略词

缩略词英文名称中文名称

ADCadenocarcinoma腺癌

Ampampicilin氨苄青霉素

BSABovineserul丽albumin牛血清白蛋白

CAMCelladhesionmolecule细胞粘附分子

cDNAcomplementaryDNA互补DNA

DAPI4’，6’一diamidino-2一phenylindole4，6一联脒一2一苯基吲哚二盐酸

dihydrochloride盐

DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯

DMEMDulbecco’SModifiedEagleMedium叫EM培养基

嘣SOdimethylsulfoxide二甲基亚砜

DNA—PKDNA。

。

dependentproteinkinaseDNA蛋白激酶

蜊^一PZcsDNA-。

dependentproteinkinasecatalyticsubunitDNA蛋白激酶催化亚单位

DSBDoublestrandbreakDNA双链断裂

ds心ADoublestrandRNA双链RNA

EBethidiumbromide溴化乙锭

E（湖Extracellularmatrix细胞外基质

EDTAethylenediaminetetranceticacid乙二胺四乙酸

E（；FRepidermalgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体

FITcFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素

FNfibronectin纤维粘连蛋白

GFPGreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白

-87．

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HEHematoxylinEoslin苏木精一伊红

HERHumanepidermalreceptor人表皮受体

HRHomologousrecombination同源重组

IgG—HRPIgG—HorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶标记的IgG

IHCIrmunohistochemistry免疫组织化学

IfrI'Gisopropyl—l—thio—B—D-galactoside异丙基一B—D一半乳糖苷

LNlatainin层粘连蛋白

删CMitomycinC丝裂霉素C

NHEJNon—homologousendjoining非同源末端连接

姗厂r3-（4，5）一dimethylthiahiazo（一z—y1）一3，5—di—四氮唑蓝

phenytetraz01iumromide

ODopticdensity光密度

PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳

PBSphosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液

P（mProgrammedcelldeath程序性细胞死亡

PIPropidiumIodide碘化丙锭

PlISFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟吣Post—。

transcriptionagenesilencing转录后基因沉默P、『DFPolyvinylidenFluoride聚二氟乙烯

RdRPRNAdependent鼢峨polymeraseRNA依赖RNA聚合酶

RISCRNAinducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合物

RNAiRNAinterferenceRNA干扰

rpmRoundperminute转每分

RT—PCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录一聚合酶链反应

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SCCSquamouscellcarcinoma鳞状细胞癌

SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠

shRNAShorthairRNA短发夹RNA

siRNASmal1interferenceRNA小分子干扰RNATEMEDN，N，N，N—tetr锄ethyletMlenediamine四甲基氨基乙胺Tristrishydroxymethhylaminomethane三羟甲基氨基甲烷

T刚师TNFreceptorassociatedfactor肿瘤坏死因子受体相关因子

v眦VonWi1lebrandfactorAvWA结构域

X—gal5-bromo。

_,4-_-chloro‘_-3。

。

indolyl‘。

beta．_。

D-galactopyr5一溴一-4一氯一吲哚一B一旷半乳

anoside糖苷

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本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。

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位论文。

‘

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技术路线

JIJJ

■■■■V

体内外细胞恶性表型的研究Ku80沉默后细胞株促进细胞凋亡放射敏感性分析

JlI

生长曲线DAPI染色克隆形成实验

平板克隆流式细胞仪分析细胞周期

粘附试验GENMED．FACS分析细胞凋亡

侵袭能力实验裸鼠移植瘤生长实验

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中文摘要

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均很高。

Ku80是一种DNA结合蛋白，主要参与非同源末端连接修复DNA双链断裂，此外，在维持端粒结构的稳定性，免疫球蛋白V（D）J链重排及调控特定基因转录等方面起着重要作用。

近年来研究发现，Ku80蛋白与食管癌的发生和发展密切相关。

然而关于Ku80蛋白在食管癌发生、发展中的具体机制目前还未见报道。

我们通过对26例食管癌标本和10例食管癌旁标本的免疫组织化学分析，发现在食管癌组织中有高水平的Ku80蛋白表达。

进一步检测不同肿瘤细胞系及胚肾细胞系中Ku80蛋白表达得到了相似的结果，在不同肿瘤细胞系中都有高水平的KuSO蛋白表达，且以食管癌细胞系EC9706最高。

RNAi技术是近年来新发展起来的研究基因功能的强有力工具，本实验成功构建了pGCshRNA-KuSO载体。

通过转染食管癌细胞系EC9706，经G418筛选得到了稳定的Ku80基因沉默食管癌细胞系。

研究结果表明，Ku80基因沉默对体外食管癌细胞的增殖、粘附和侵袭能力均有抑制作用。

体内实验显示，Ku80基因沉默能抑制食管癌细胞裸鼠移植瘤的生长。

Ku80基因沉默能提高Y一射线和丝裂霉素C药物的敏感性，促进Y一射线和MMC诱导食管癌细胞发生凋亡，并使细胞周期阻滞于G：

朋期。

总之，我们的研究首次为Ku80具有促进肿瘤细胞增殖、粘附和侵袭能力及在食管癌发生、发展起着重要作用提供了实验依据。

同时证实了Ku80基因沉默可提高肿瘤细胞对Y一射线和药物的敏感性，为今后应用于临床治疗奠定了理论基础。

关键词：

Ku80蛋白；射线敏感性：

肿瘤；增殖；细胞凋亡

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Abstract

Esophagealcancerisoneofthemostcommonmalignanttumors，whichmorbidityandmortalityarehigh．Ku80isaDNA-bindingproteinandmainlyjoinsin

non·homologousendjointandrepairsDNAdouble—strandbreak．Moreover,itplaysan

importantroleinmaintainingthestabilityoftelomerestructure，rearrangementofimmunoglobulinV（D）J，controllingspecificgenetranscription．Inrecentstudies，itisknownthatKu80iscloselyrelatedtotheoccurrenceanddevelopmentofesophagealcRnceLButthespecificmechanismofKu80proteinintheoccurrenceanddevelopment

ofesophagealcancerisstillnotreported．

Throughimmunohistochemicalanalysisof26casesofesophagealcancerspecimensand10casesofadjacentesophagealcancerspecimens，wefoundthatthereisahighlevelexpressionofKu80proteininesophagealcancertissue．Inourexperiments，Ku80proteinexpressionsindifferenttumorcelllinesandembryonickidneycelllineHEK．293wereanalyzed．Thereisahi曲levelofKu80proteinexpressionindifferenttumorcelllines，

especiallyinesophagealcancercelllinesEC9706．

RNAitechnologyisanewandpowerfultoolforresearchinggenefunctioninrecentyears．WesuccessfullyconstructedpGCshRNA-Ku80vector,andgotstablesilencingofKu80geneofesophagealcarcinomacelllinebytransfectingesophagealcancercellsEC9706andselecting、ⅣitllG418．

Ourresearchshowedthatcellsproliferation,adhesionandinvasionwereinhibitedinesophagealcancercellsbysilencingKu80geneinvitro．Invivoexperiments，itWasshowedthatsilencingKu80genecouldinhibittumorigenicityinaxenograflmodelof

nudemice．

SilencingKu80genecouldincreasethesensitivityoftumorcellstoY—raysandmitomycinC，whichpromotedesophagealcancercellapoptosisinducedbyY·raysandMMC．SilencingKuS0genemadecellarrestedinGe／Mphaseofcellcycle．

Inconclusion,itWaSconfirmedfirstlythatKuS0couldpromoteesophagealcancercellsproliferation,adhesionandinvasioninourexperiments．Thus，Ku80playsallimportantroleintheoeeulTonceanddevelopmentofesophagealcanceLMoreover,silencingKu80genecouldincreasethesensitivityofY—raysandchemicals，whichprovideatheoreticalbasisforapplyinginclinicalcancertherapyinthefuture．

Keywords：

Ku80protein；radiationsensitivity；Neoplasm；proliferation；apoptosis

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翮吾

食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，在各种癌症死亡率中居第6位；每年新增患者超过30万人，并且大多发生于发展中国家。

食管癌发病具有明显的地区性。

食管癌高发区和低发区的发病率达到20倍的差别。

食管痛高发区包括亚洲（特别是中国、新加坡和伊朗）、东南部非洲和法国北部。

我国是食管癌高发国家，尤其以河南林县、太行山区、苏北地区、大别山区、川北地区、潮汕地区以及新疆哈萨克族聚居地区为主。

在我国，食管癌居恶性肿瘤发病率和死亡率的第二位，仅次于胃癌。

早期治疗5年生存率可达90％一100％，治疗越晚，生存率越低，死亡率越高。

食管癌主要有鳞状细胞癌（SquamouscellCarcinoma，SCC）和腺癌（Adenocarcinoma，ADC）两种形式，他们的病因学和病理学特征有很大不同。

西

方国家以腺癌多见，我国以鳞癌为主，占9096以上伍射。

尽管食管癌的病因和发病机理迄今尚未完全阐明，但通过近20多年的不断研

究也取得了很大进展。

目前认为食管癌是环境因素和遗传因素综合作用的结果。

环境因素包括：

人类乳头瘤病毒感染、亚硝胺类化合物摄入过多、霉菌污染、营养膳食失衡、微量元素缺乏（锌、硒、钼等）和不良的生活饮食习惯（吸烟、饮酒、嗜过热过粗或刺激性食品）∽1。

遗传因素也不容忽视，研究证明：

基因的多态性在食管癌发展过程中起重要作用[9-11]o另外，食管癌病人有癌家族史的比例显著高于对照组‘1钉。

现代医学认为肿瘤是一种基因病，癌变组织存在基因表达或DNA结构的缺陷或变异。

食管癌的发生发展也是如此。

随着分子生物学的发展，发现食管癌的发生发展过程中涉及到多个基因的改变，是多个基因协同作用的结果。

研究表明：

食管癌是发生在食管上皮的单纯增生、不典型增生、原位癌、浸润癌整个自然病史中的多因素、多阶段、多基因变异累积及其相互作用的复杂过程n加。

在细胞癌变的过程中，细胞周期中的多种调节因子参与细胞的癌变。

其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。

由于食管癌在我国是高发病率和高死亡率，因此对食管癌的病因和发病机理进行深入研究有着十分重要的意义。

}tanahann铂将肿瘤的发生发展归结为六大事件：

细胞获得自主性增殖；阻止细胞增殖的信号失灵；促进细胞分化的系统障碍；逃避细胞凋亡机制；诱导血管生成；具有侵袭能力。

因此我们要研究肿瘤的生物学行为也要围绕这些方面展开。

细胞的生长与分裂失去控制是肿瘤细胞基本的生物学特征。

正常的个体中，细胞的增殖受到严密的基因调控。

各个基因之问相互识别，相互促进而又相互抑制使机体处于稳态。

肿瘤的发生是由突变的细胞异常增殖形成的。

由于机体内正常基因对突变基因不识别，失去原来具有的抑制功能，使得突变细胞处于持续的增殖状态。

细胞凋亡（apoptosis）是细胞死亡的另一种方式，又称程序性细胞死亡

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（ProgrammedCellDeath，PCD），是细胞受某种信号刺激后的一种主动细胞“自杀"消亡过程。

肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡平衡失调的结果，细胞凋亡信号传递紊乱即会影响细胞凋亡的过程，是肿瘤形成的重要机制。

细胞凋亡的抑制打破了细胞增生和细胞死亡的平衡，本应该程序性死亡的细胞如未按时凋亡，则这种“老化’’细胞的染色体会不稳定，基因易突变，对致癌物的易感性升高，从而增加了恶变的概率。

侵袭性和转移性是肿瘤细胞的生物学特征中最为关键的。

据临床统计，有80％以上的肿瘤患者死于侵袭和转移，并且肿瘤的侵袭和转移也是肿瘤治疗失败的主要原因，所以抗肿瘤侵袭与转移的研究一直受到人们的特别关注。

肿瘤侵袭和转移是一个主动过程，liottan51曾经把这一过程概括为三个步骤：

l肿瘤细胞与细胞外基质成分粘附；2肿瘤细胞释放或诱导释放蛋白水解酶，降解细胞外基质；3降解区域肿瘤细胞在趋化因子引导下迁移。

因此，细胞的黏附，ECM的降解，以及肿瘤细胞的迁移等均是肿瘤侵袭和转移的关键步骤。

细胞粘附包括癌细胞与癌细胞之间的同质性粘附和癌细胞与基质细胞之间的异质性粘附。

细胞粘附在恶性肿瘤转移过程中发挥着重要作用。

一方面肿瘤细胞间的附着减弱，使肿瘤细胞脱离与周围细胞的附着，这是肿瘤侵袭及转移的第一步。

另一方面，肿瘤细胞粘附于基质和血管内皮细胞，并进入血循环造成血行转移nH"。

肿瘤细胞在侵袭和转移过程中必须要破坏由细胞间基质和基底膜组成的细胞外基质。

在癌细胞与基底膜紧密接触4-8小时后，细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）的成分如纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）、层粘连蛋白（Laminin，LN）、蛋白多糖和Ⅳ型胶原蛋白（typeIVcollagen）可被癌细胞直接分泌的蛋白溶解酶（Ⅳ型胶原酶、尿激酶型胞浆素原活化物、组织蛋白酶D）溶解，使基底膜产生局部缺损，癌细胞本身也可诱导宿主细胞产生蛋白酶促使ECM溶解。

这样癌细胞可通过缺损的EcM进入血液循环n删。

肿瘤细胞在趋化因子作用下的积极活动也是肿瘤细胞进入或移出血管的前提。

癌细胞通过被溶解的ECM缺损处游出是借助阿米巴运动。

癌细胞穿过基底膜后，进一步溶解间质的结缔组织在间质中移动，到达血管壁时可以以同样方式穿过血管的基底膜进入血管比¨。

由此可见，肿瘤的侵袭和转移是一个有多种因子参与的多步骤的复杂的生物学过程。

目前，越来越多的食管癌研究集中于癌基因、抑癌基因及细胞周期调节蛋白，研究人员试图阐明这些分子与食管癌的临床病理特点及预后的关系，以作为食管癌诊断、预后的指标。

但很少有人报道DNA修复蛋白与食管癌发生发展有关，本文重点阐明了DNA修复蛋白Ku80在食管癌发生发展中的作用及其机制的实验研究。

Ku蛋白是异二聚体，由Ku80（Ku86）和Ku70两个亚单位构成，作为一种DNA结合蛋白广泛存在于哺乳动物细胞内。

最初是作为一种自身抗原首先在硬皮病患者

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的血清中被发现的，它的命名来自于第一位患者名字的前两个字母∞1。

目前已证实：

Ku蛋白在DNA损伤修复过程中起着关键作用。

在DNA损伤中DNA双链断裂（DoubleStrandBreak，DSB）是最致命的，哺乳动物细胞有两种主要修复方式：

同源重组修复（HomologousRecombination，HR）和非同源末端连接（Non—homologousEndJoining，NHEJ）。

而且后者在哺乳动物细胞内是更重要的。

HR修复是依靠未损伤同源DNA为模板拷贝完整信息促进DNA双链断裂的准确修复；而NHEJ修复是不依赖序列直接把断裂的末端相连的修复。

目前认为：

NHEJ途径至少有六种核心因子参与，即Ku异二聚体（Ku80和Ku70）和DNA蛋白激酶催化亚单位（DNA-PKcs）所组成DNA蛋白激酶（DNA-PK）及XRCC4-连接酶Ⅳ复合体防加。

此外，最近还发现Artemis核酸酶也参与NHEJ过程旧1。

具体过程是：

首先2个Ku蛋白分子（Ku70和Ku80）分别识别并结合到DNA双链断裂末端，然后此复合物招集DNA-PKcs到损伤部位与之结合并激活其激酶活性，同时也招集其他蛋白质参与DNA修复，最后DNA断裂末端通过相互独立的结合位点或相互作用由XRCC4-连接酶Ⅳ复合体完成连接。

在连接之前，DNA-PK发生自身磷酸化，使DNA-PKcs和Ku蛋白异二聚体从DNA链解离下来，进行下一个NHEJ过程。

Artemis具有核酸内切酶和外切酶活性，它可以切除不能互补的核苷酸直到找到可互补的I-6不等的核苷酸完成DSB末端相连。

当损伤的DNA未得到完全修复时，可导致基因组的不稳定、免疫缺陷和肿瘤易感性等。

因此，Ku蛋白被认为维持基因组稳定性的caretaker蛋白啪1。

Ku蛋白除了作为DNA修复蛋白外，还参与多种生理功能：

如维持端粒结构稳定、免疫球蛋白编码基因V（D）J链重排、调控特定基因转录及调控细胞周期G：

／M期等

溉311

o

近年来，随着对Ku蛋白的研究不断深入，发现Ku蛋白与肿瘤的发生发展、肿瘤的放化疗抵抗性相关，以及利用调节Ku蛋白来提高肿瘤治疗的效果等。

研究表明：

Ku蛋白在许多肿瘤组织中有着异常表达并与肿瘤的发生、病程的进展密切相关。

Rigas啤1等用免疫组化方法对人正常结肠组织、结肠腺瘤、结肠癌和结肠周边的正常组织中的Ku蛋白表达水平研究发现，在结肠腺瘤中Ku70／Ku80水平只有结肠癌的1／3-1／2水平，但两者均较正常结肠组织低。

Korabiowska田1等也报道在结肠肿瘤中Ku70／KuSO表达水平下调，而且在遗传性结肠肿瘤中更多见。

然而，HosoiⅢ1等观察了12例结肠癌患者，结果显示肿瘤组织内的Ku蛋白的mRNA表达及DNA-PK活性都明显高于周围的正常组织，且与转录因子spl启动子区域的识别因子有高度的一致性。

Tonotsuka瞪1等研究13例食管癌患者发现，肿瘤组织对比正常