Cas9sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率.docx
- 文档编号:7720953
- 上传时间:2023-01-26
- 格式:DOCX
- 页数:6
- 大小:23.08KB
Cas9sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率.docx
《Cas9sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《Cas9sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率.docx(6页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
Cas9sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率
Cas9-sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率
俞珺瑶,李晓兰,张健萍,程涛,张孝兵
【摘要】[摘要]目的:
为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率,比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA(sgRNA)的不同载体设计对其打靶效率的影响。
方法:
将针对AAVS1位点的2个sgRNA序列分别插入表达Cas9的质粒pSpCas9上,再将其构建为Cas9-sgRNA二合一的共质粒以及独立表达sgRNA和Cas9的双质粒系统;质粒转染293T细胞后,用T7E1酶切方法检测打靶效率。
结果:
不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切;Cas9-sgRNA共质粒系统的打靶效率显著高于双质粒系统。
结论:
T7E1酶切方法可去除变性退火步骤,简化了传统的检测方法。
采用Cas9-sgRNA共表达的载体设计可显著提高打靶效率。
【期刊名称】生物技术通讯
【年(卷),期】2015(000)004
【总页数】5
【关键词】[关键词]CRISPR/Cas9;AAVS1位点;T7E1酶切方法;打靶效率
CRISPR/Cas是细菌和古细菌在生物进化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,用来对抗入侵的病毒(噬菌体)及外源DNA。
CRISPR/Cas系统通过将噬菌体和外源DNA的片段整合到CRISPR回文重复序列中,当外源DNA再次入侵时,细胞表达的CRISPRRNA(crRNA)引导Cas核酸内切酶迅速切割外源DNA,从而起到免疫防御的作用[1-3]。
该系统主要包括3个部分[4-5]:
①CRISPR相关(CRISPR-as⁃sociated,Cas)蛋白,包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2等;②crRNA,由一系列重复序列(directrepeats)和外源DNA来源的间隔序列(spacer)组成;③反式激活crRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA),帮助crRNA的成熟及其作用的发挥。
目前在基因打靶中最常用的是Ⅱ型CRISPR系统,该系统来源于嗜热性链球菌,Cas9是其主要的功能蛋白,具有核酸内切酶作用。
近年来通过一系列改造,已实现了CRISPR/Cas9对真核细胞基因组的特异性修饰[6-8]。
2013年,Mali[9]等将crRNA-tracrRNA融合为小向导RNA(smallguideRNA,sgRNA),简化了操作步骤。
这种改造的sgRNA现已被广泛应用于基因编辑研究。
Cas9-sgRNA系统进行基因打靶的原理是:
Cas9-sgRNA复合物在与前间区序列邻近基序(pro⁃tospaceradjacentmotif,PAM)毗邻的匹配靶DNA结合后,Cas9发生构象改变,激发内切酶活性,引起DNA双链断裂(doublestrandbreaks,DSB)。
在没有导入包含同源重组臂的外源DNA模板的情况下,细胞将通过非同源末端连接(non-homologous-endjoining,NHEJ)的方式修复DSB[10]。
这种修复方式会在缺口处随机插入或删除若干核苷酸,通常会导致移码突变,引起基因功能的丧失。
相对于早期的锌指核酸酶(ZFN)及类转录活化因子核酸酶(TALEN)来说,CRISPR/Cas9系统通过不同的sgRNA来引导Cas9去识别和切割靶序列DNA[11-12]。
这一基于RNA的基因定点修饰工具操作极为简单,因此引起了科学家们的强烈关注。
但目前CRISPR/Cas9系统的打靶效率依然偏低,若能使这一系统的基因定点编辑能力大幅度提高,未来人们将可以通过修复致病基因达到治疗多种疾病的目标[13]。
在此,我们试图通过改良载体设计来提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率。
1材料和方法
1.1材料
293T细胞(本室保存);大肠杆菌Stbl3感受态、FastPfuPCRSuperMix(Transgene公司);pSpCas9(BB)-2A-GFP、pSpCas9(BB)-2A-Puro、sgRNAAAVS1-T1和T2质粒(Addgene公司);限制性内切酶BbsⅠ和T4DNA连接酶(Thermo公司);DMEM高糖培养基及胎牛血清(FBS)(Hyclone公司);ImPromⅡReverseTranscriptionSystem(Promega公司);2×SYBRGreenMix(Roche公司);GenomicDNAEx⁃tractionKit(TaKaRa公司);RNeasyMiniKit、RNase-FreeDNaseSet(QIAGEN公司);Lipo⁃fectAMINE2000(Invitrogen公司);T7E1酶(北京泊宁乐成公司);AAVS1T1/T2oligos、PCR及RT-PCR引物由Invitrogen公司合成。
1.2质粒构建
合成的AAVS1sgRNAoligos序列信息见表1。
pSpCas9-sgRNA质粒构建分3步进行(图1)。
首先,对sgRNAoligos进行磷酸化和退火,形成具有粘性末端的双链。
反应体系:
1μLsgRNAtop(100μmol/L)+1μLsgRNAbottom(100μmol/L)+1μL10×T4DNA连接酶缓冲液+1μLT4多核苷酸激酶(PNK)+6μLddH2O。
反应条件:
37℃30min,95℃5min,再以5℃/min的速度降至25℃。
然后,将sgRNAoligos分别克隆至pSpCas9(BB)-2AGFP、pSpCas9(BB)-2A-Puro载体[14]中。
酶切及连接反应体系:
100ngpSpCas9(BB)+2μLsgRNAoli⁃gos(1∶200稀释)+2μL10×Tango缓冲液+1μLDTT(10mmol/L)+1μLATP(10mmol/L)+1μLFastDigestBbsⅠ+0.5μLT4DNA连接酶,加ddH2O至20μL。
反应条件:
37℃5min,21℃5min,6次循环。
最后,取2μL连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态,挑取克隆测序鉴定,测序引物为U6-Fwd,序列信息参见表1。
1.3细胞培养及转染
用DMEM+10%FBS培养293T细胞。
转染前1d用0.25%的胰酶消化细胞并计数,取6×105细胞接种至六孔板的一个孔,当细胞汇合度达60%~70%时,用LipofectAMINE2000(Lipo)介导打靶质粒的转染。
分别配制质粒和Lipo混合液(六孔板每孔):
①6μLLipo加至100μLOPTI-MEM中,混匀后静置5min;②3μgpSpCas9-AAVS1T1/2或1.5μgpSpCas9、1.5μgsgRNAAAVS1-T1/2加至100μLOPTI-MEM中,混匀后与Lipo混合液混合,静置20min。
将混合液逐滴加入六孔板中,200μL/孔,混匀。
37℃、5%CO2温箱中培养,6~8h后换新鲜的DMEM/10%FBS,37℃、5%CO2温箱中继续培养。
转染后24h,加1μg/mL嘌呤霉素进行筛选,48h后收取细胞;或转染后48h流式分选GFP+细胞,用于检测打靶效率。
1.4PCR扩增及T7E1酶切分析
收取细胞后,用GenomicDNAExtractionKit提取基因组DNA,用2×FastPfuPCRSuperMix扩增含有NHEJ的AAVS1片段,酶、模板、引物等具体用量参照FastPfuPCRSuperMix说明书,所使用的引物为AAVS1CEI-IFwd/Rev,序列信息参见表1。
PCR体系为20μL,反应条件:
98℃变性10s,62℃退火20s,72℃延伸1min,35个循环。
用T7E1酶切PCR产物。
酶切体系(20μL):
PCR产物10μL,10×缓冲液2μL,T7E1酶1μL,ddH2O7μL,37℃反应30min。
2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带,用ImageJ软件分析条带的灰度值,按下式计算InDel(%):
其中a为主带的灰度值,b和c为酶切条带的灰度值。
1.5RNA提取及RT-PCR
收取嘌呤霉素筛选48h(或流式分选)后的293T细胞,用RNeasyMiniKit提取RNA,在提取过程中用RNase-FreeDNaseSet处理以去除细胞内的质粒DNA,具体步骤参照RNeasyMinikit说明书。
取1μgRNA用ImPromⅡReverseTranscriptionSystem进行逆转录,反应体系为20μL,具体试剂用量及步骤参照其说明书。
将逆转录得到的20μLcDNA稀释至100μL,取3μLcDNA加ddH2O至8μL,再与1μLCas9-Fwd、1μLCas9-Rev、10μL2×SYBRGreenMix混合,得到20μL反应体系,按95℃15s、60℃60s进行40个循环。
以hGAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法计算Cas9的相对表达量。
Cas9-Fwd和Cas9-Rev引物信息参见表1。
2结果
2.1对打靶效率检测方法的简化
检测CRISPR/Cas9系统打靶效率的常用方法是T7E1酶切分析。
其常规步骤是:
PCR扩增经打靶后的目的DNA片段,PCR产物通过变性退火形成杂交双链,T7E1核酸内切酶识别碱基不配对的区域,并对该区域进行切割。
我们偶然发现PCR产物不经变性退火,直接用T7E1酶切,对结果没有影响。
图2显示,是否包括变性退火步骤检测得到的切割效率均为17%左右。
我们推测,导致这一结果的可能原因是,在PCR后期,反应体系中主要成分已耗尽,几乎没有新的PCR产物形成,因此合成的DNA链在后续循环中通过变性、退火已形成杂交双链。
这一发现对简化T7E1分析操作步骤很有意义,在以下的研究中,我们采用这一方法检测DNA打靶效率。
2.2共质粒系统提高打靶效率
如何提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率,是研究人员共同关心的一个问题。
在以前的报道中,通常用2种方式来表达Cas9和sgRNA,一种是用2个质粒分别表达Cas9和sgRNA[9],另一种方法是用一个质粒同时表达Cas9和sgRNA[15],但哪一种更好尚未见研究报道。
我们推测,利用一个载体同时导入Cas9和sgRNA两种组分可以维持它们的均衡表达,这样可以提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率。
为验证这一假设,我们针对AAVS1位点设计了2个sgRNA,即sgAAVS1-T1和sgAAVS1-T2,然后克隆到带有sgRNA骨架结构的pSpCas9质粒上,构建同时带有Cas9和sgRNA两种组分的共质粒,并与Cas9和sgRNA分别携带在2个质粒上的方式进行了比较。
我们之所以选择AAVS1,是因为它是靶向基因治疗中最常选用的“安全港”[16]。
为减少不同批次实验误差对结果的影响,我们计算了相对切割效率(relativeInDel),其中的sgAAVS1-T2与预期结果一致,共质粒系统比双质粒系统打靶效率提高80%(图3A)。
然而出乎意料的是,另一个sgRNA(sgAAVS1-T1),共质粒系统没有显著提高打靶效率(图3A)。
我们进一步推测,这可能是由于不同质粒之间转染效率不同所致。
由于我们的质粒系统共表达绿色荧光蛋白(GFP),用流式细胞仪可以精确测定转染效率。
图3B显示,表达sgAAVS1-T2的一对质粒的转染效率均为32%,而表达sgAAVS1-T1的一对质粒的转染效率有显著差异(33%vs28%,P<0.05)。
这一结果可以解释为何表达sgAAVS1-T1的共质粒没有提高打靶效率。
sgAAVS1-T1共质粒转染效率降低的原因不明,可能与DNA的质量偏低有关。
我们认为,为准确测定共质粒和双质粒系统的打靶效率,应该去除转染效率对结果的影响。
因此,我们在转染2d后,用流式细胞仪分选出GFP+细胞继续培养2~3d,或加嘌呤霉素筛选48h,然后提取DNA,利用T7E1分析检测打靶效率。
结果如图3C,对于2个不同的sgRNA,共质粒系统比双质粒系统的打靶效率均提高30%~40%(P<0.05,n=3)。
综合上述结果,我们得到结论,利用一个载体同时表达Cas9和sgRNA可以显著提高打靶效率。
2.3打靶效率与Cas9表达水平呈正相关
我们进一步研究了共质粒系统能够显著提高靶DNA切割效率的原因。
我们推测,这可能和不同系统的Cas9表达水平有关。
为此,我们收获经嘌呤霉素筛选48h后的293T细胞,利用RT-PCR检测细胞内Cas9的mRNA表达水平。
结果显示,对于2个不同的sgRNA,共质粒表达的Cas9mRNA都比双质粒系统高2~3倍(图4)。
这一结果提示,共质粒系统打靶效率增高的原因可能是这种载体设计方式可以提高Cas9的表达量,从而提高DNA切割效率。
3讨论
CRISPR/Cas9作为革命性的基因编辑工具,在基础研究和转化研究中有广阔的应用前景,已用于多个物种细胞的基因敲除、基因修饰等[17]。
我们的研究结果对进一步提高基因编辑效率和简化检测方法有一定的指导意义。
我们发现,利用一个质粒同时表达Cas9和sgRNA可以显著提高靶DNA的切割效率,尤其是在排除转染效率这个影响因素之后。
其主要原因是这种载体设计可以使Cas9mRNA的表达量提高2~3倍。
我们还发现,检测靶DNA切割效率的常用方法T7E1分析可以进一步被简化。
在以往的T7E1检测中,需要对目的片段进行变性、退火,形成杂交双链。
而我们在实验中发现,不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切,这种PCR后直接酶切的方式并不会造成最后分析结果的偏差。
使用这一简化的方法有利于提高工作效率。
本研究中所设计的sgRNA针对人19号染色体的AAVS1位点。
最初是因为发现在使用腺相关病毒载体(AAV)时,病毒载体很容易整合到人类第19号染色体的特异位点,所以将这个特异位点命名为AAVS1。
AAVS1有蛋白表达功能,表达目前认为无功能的P84蛋白,在该区域定点插入外源序列,不会引起随机整合造成的原癌基因的激活,被认为是基因打靶的“安全港”。
目前已有相关研究[18-20]在人多能干细胞(hPSC)的AAVS1位点插入干扰基因表达的shRNA、参与细胞分化调控的各种因子,以及报告筛选系统(如Neo、GFP等)的相关序列来研究人干细胞的各种生物学功能。
也有其他研究[21-22]利用该位点来表达外源功能性蛋白,如血友病FⅧ、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)等。
我们的研究结果为进一步在AAVS1区域进行各种功能性修饰奠定了基础。
参考文献
[1]DeveauH,GarneauJE,MoineauS.CRISPR/Cassystemanditsroleinphage-bacteriainteractions[J].AnnRevMicrobiol,2010,64:
475-493.
[2]HorvathP,BarrangouR.CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea[J].Science,2010,327:
167-170.
[3]MakarovaKS,HaftDH,BarrangouR,etal.EvolutionandclassificationoftheCRISPR-Cassystems[J].NatRevMicro⁃bio,2011,9:
467-477.
[4]HorvathP,Coute-MonvoisinAC,RomeroDA,etal.Com⁃parativeanalysisofCRISPRlociinlacticacidbacteriage⁃nomes[J].IntJFoodMicrobiol,2009,131:
62-70.
[5]HaftDH,SelengutJ,MongodinEF,etal.Aguildof45CRISPR-associated(Cas)proteinfamiliesandmultipleCRISPR/Cassubtypesexistinprokaryoticgenomes[J].PLoSComputBiol,2005,1:
e60.
[6]FriedlandAE,TzurYB,EsveltKM,etal.Heritablege⁃nomeeditinginC.elegansviaaCRISPR-Cas9system[J].NatMethods,2013,10:
741-743.
[7]WangH,YangH,ShivalilaCS,etal.One-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Casmediatedgenomeengineering[J].Cell,2013,153:
910-918.
[8]JiangW,ZhouH,BiH,etal.DemonstrationofCRISPR/Cas9/sgRNA-mediatedtargetedgenemodificationinArabidop⁃sis,tobacco,sorghumandrice[J].NucleicAcidsRes,2013,41:
e188.
[9]MaliP,YangL,EsveltKM,etal.RNA-guidedhumange⁃nomeengineeringviaCas9[J].Science,2013,339:
823-826.
[10]BarnesDE.Non-homologousendjoiningasamechanismofDNArepair[J].CurrBiol,2001,11:
R455-457.
[11]GajT,GersbachCA,BarbasCF3rd.ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering[J].TrendsBiotechnol,2013,31:
397-405.
[12]MaliP,EsveltKM,ChurchGM.Cas9asaversatiletoolforengineeringbiology[J].NatMethods,2013,10:
957-963.
[13]LiHL,NakanoT,HottaA.Geneticcorrectionusingengi⁃neerednucleasesforgenetherapyapplications[J].DevGrowthDiffer,2014,56:
63-77.
[14]RanFA,HsuPD,WrightJ,etal.Genomeengineeringus⁃ingtheCRISPR-Cas9system[J].NatProtocols,2013,8:
2281-2308.
[15]CongL,RanFA,CoxD,etal.Multiplexgenomeengineer⁃ingusingCRISPR/Cassystems[J].Science,2013,339:
819-823.
[16]DeKelverRC,ChoiVM,MoehleEA,etal.Functionalge⁃nomics,proteomics,andregulatoryDNAanalysisinisogenicsettingsusingzincfingernuclease-driventransgenesisintoasafeharborlocusinthehumangenome[J].GenomeRes,2010,20:
1133-1142.
[17]MaY,ZhangL,HuangX.GenomemodificationbyCRISPR/Cas9[J].FEBSJ,2014,281:
5186-5193.
[18]LuoY,LiuC,CerbiniT,etal.Stableenhancedgreenfluores⁃centproteinexpressionafterdifferentiationandtransplantationofreporterhumaninducedpluripotentstemcellsgeneratedbyAAVS1transcriptionactivator-likeeffectornucleases[J].StemCellsTranslationalMed,2014,3:
821-835.
[19]TiyaboonchaiA,MacH,ShamsedeenR,etal.UtilizationoftheAAVS1safeharborlocusforhematopoieticspecifictrans⁃geneexpressionandgeneknockdowninhumanEScells[J].StemCellRes,2014,12:
630-637.
[20]QianK,HuangCL,ChenH,etal.Asimpleandefficientsystemforregulatinggeneexpressioninhumanpluripotentstemcellsandderivatives[J].StemCells,2014,32:
1230-1238.
[21]LiuX,PingH,ZhangC.RapidestablishmentofaHEK293celllineexpressingFVIII-BDDusingAAVsite-specificinte⁃grationplasmids[J].BMCResNotes,2014,7:
626.
[22]LiSJ,ShiRZ,BaiYP,etal.Targetedintroductionoftis⁃sueplasminogenactivator(TPA)attheAAVS1locusinmesen⁃chymalstemcells(MSCs)anditsstableandeffectiveexpres⁃sion[J].BiochemBiophysResCommun,2013,437:
74-78.
doi:
10.3969/j.issn.1009-0002.2015.04.001
基金项目:
科技部干细胞重大专项(2015CB964902,2013CB966902)
【文献来源】
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- Cas9sgRNA 质粒 系统 提高 AAVS1 打靶 效率
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)