免疫组织化学.docx

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免疫组织化学

免疫组织化学的根本知识

1免疫组织化学的概念：

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反响使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

2免疫组化实验所用的抗体有哪些？

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。

多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

3免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片〔病理大片和组织芯片〕和冰冻切片，细胞标本包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最根本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回忆性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

4石蜡切片为什么要做抗原修复？

有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了局部抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

5免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为根底的检测方法。

这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

6抗体交叉反响的原因：

指抗体除与其相应的抗原发生特异性反响外还与其它抗原发生反响。

产生的原因有以下几个方面：

1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。

任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反响。

2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。

3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反响。

当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。

免疫细胞化学技术 

一、免疫细胞化学技术的概述

*免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 

-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反响使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。

（一） 对抗原和抗体的要求 

*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。

-对抗体的要求：

纯度高、比活性强； 

*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。

-对抗原的要求：

纯度高，免疫原性强，稳定无变化。

（二） 抗原 （antigen, Ag） 

*抗原的概念：

但凡在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反响的物质，称为抗原。

抗原具有两个方面的特性：

-免疫原性：

引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性； 

-免疫反响性：

抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反响的特性。

*根据抗原是否显示免疫原性分为：

-完全抗原：

分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。

*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

-半抗原：

又称为不完全抗原，分子量较小。

例如：

某些短肽、多糖、类脂和药物等。

*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。

载 体 

*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。

-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。

结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。

〔三〕抗体 （antibody, Ab） 

1、抗体的概念：

*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内； 

-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。

-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：

单克隆抗体和多克隆抗体。

*单克隆抗体：

是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

-特异性强、抗体产量高。

*多克隆抗体：

是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

-特异性低，会产生抗体的交叉反响。

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色时机。

-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。

3、抗体的制备——多克隆抗体的制备 

*动物的选择 

*佐剂（adjuvant） 

*免疫方法 

*免疫剂量 

*抗体效价的测定 

*放血或定期抽血 

免疫组化常见问题及解决方法

当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色

① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

② 确认所有的试剂是否按正确的顺序参加，是否孵育了足够的时间。

③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。

比方，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM〔不是IgG〕二抗。

④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应防止反复冻融，试剂保存时一定要防止与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥ 检查标本的储存条件，最好用阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体参加到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，那么可排除底物的因素。

需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否那么会失效。

⑧ 检查冲洗液是否和反响试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：

① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。

一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最正确的使用浓度。

④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

⑤ 孵育时切片是否放置水平，否那么会导致抗体流失。

如果阴性对照没有反响，阳性对照反响良好，而标本弱阳性，那么可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。

非特异性染色

① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。

应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。

处理的方法为：

灭活碱性磷酸酶：

最常用的方法是将左旋咪唑〔24mg/m1〕参加底物液中，并保持pH值在，即能除去大局部内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素：

消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。

具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。

② 是否选择使用了正确的封闭血清。

电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。

有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。

另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。

最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。

③ 所选择的抗体是否符合试验要求。

因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

④ 一抗的使用浓度是否过高。

⑤ 清洗是否充分。

应严格操作规程。

因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内参加吐温20，效果更佳。

特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。

⑥ DBA的使用是否正确。

DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否那么可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。

另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光枯燥处，现用现配，临用前加H2O2。

孵育时间过长也会造成背景染色。

⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否那么会造成边缘部的非特异性染色。

⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反响。

抗体的保存

抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。

如储存的抗体中蛋白浓度很低〔10-100Mg/L〕，就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。

绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。

抗体原液和已别离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并防止反复冻融。

冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对防止用高温快速解冻。

被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。

为防止细菌污染，可于抗体溶液中参加0.01%叠氮钠。

抗体经真空冷冻枯燥后置-20℃以下可保存3-5年。

保存稀释后的单抗应参加0.1%叠氮钠浓度。

大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丧失抗原活性。

大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。

石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载玻片的处理：

抗原修复过程中