超高压对漆酶产生菌的诱变效应研究.docx
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超高压对漆酶产生菌的诱变效应研究
超高压对漆酶产生菌的诱变效应研究
王岁楼,吴晓宗,王琼波,李国富
(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,郑州450002)
摘要:
对漆酶产生菌灵芝和鸡腿菇进行超高压处理,发现致死率随剂量的增加而增加,在致死率为50%~80%的范围内诱变效果较好。
实验获得了2株具有较大应用潜力的灵芝高压突变株G1502和鸡腿菇高压突变株C2003,其中G1502酶活比出发菌株提高了2.83倍,发酵时间缩短了1d;C2003酶活比原菌株提高了2.57倍,发酵时间也缩短了1d。
关键词:
超高压;灵芝;鸡腿菇;漆酶
多年来,物理和化学诱变一直是工业微生物育种行之有效的方法。
其中物理诱变因其简单实用、效果明显而得到了更广泛的应用。
目前人们普遍采用的物理诱变方法主要有紫外线、X-射线和γ-射线等。
本文是新物理诱变源的探索。
超高压(100MPa以上压力)的生物效应是肯定的,但迄今主要局限于食品杀菌和加工处理等方面。
对食品进行高压处理具有低能量输入及保护小分子稳定性和最大限度保持食品原有生鲜风味与营养成分等优势。
但由于成本高,目前尚处于理论或实验室研究阶段。
高压会引起微生物细胞形态、细胞膜、细胞壁的变化,影响细胞内生化反应、DNA复制等[1~3],据报国外已从海洋深处筛选出了耐高压的微生物[4],国内也有人采用高压技术提高了水稻的产量[5]。
这预示着耐高压生物的客观存在及高压育种技术的可行性,本文报道我们利用超高压技术诱变选育漆酶产生菌的初步研究结果。
1材料与方法
1.1菌种
灵芝(G.lucidumKarst);鸡腿菇(Coprinusovatus)
1.2培养基
1.2.1斜面培养基[6](综合马铃薯培养基)土豆200g/L(煮沸取滤汁),葡萄糖20g/L,KH2PO43g/L,MgSO4•7H2O1.5g/L,VB10.01g/L,琼脂20g/L,pH6.0。
1.2.2液体种子培养基组成同上述斜面培养基,但不加琼脂,pH6.0。
1.2.3液体发酵培养基葡萄糖20g/L,大豆蛋白粉5g/L,KH2PO43g/L,MgSO4·7H2O1.5g/L,VB10.01g/L,pH6.0。
1.3高压处理装置
本实验所用超高压装置最大容积为15L,最高压力是800MPa,传压介质是蓖麻油,传压方式为外部加压式,即油压装置推动活塞,将传压介质泵入超高压容器处理室内,从而来改变处理室内的压力。
可用于固、液态食品的高压处理,与介质接触的部分用高强度不锈钢制成;加压过程、保压时间均由自动控制系统控制。
其基本结构如图1所示。
图1实验用超高压设备示意图
Fig.1Ultrahighpressureprocessingequipment
1—上盖 2—处理室3—高压缸 4—高压活塞
5—低压活塞 6—低压缸7—压力装置
1.4包装材料
菌液包装采用聚丙烯塑料袋(120×75mm),121℃灭菌30min后使用。
1.5初筛试剂
以0.04mol/L愈创木酚作为显色剂。
95%乙醇溶解,50mmol/L琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)配制。
1.6实验方法
1.6.1制备液体种子
用4mL无菌生理盐水洗下斜面活化菌种上的菌丝,接种于装有玻璃珠的300mL三角瓶中(内装60mL液体种子培养基),于28℃、120r/min振荡培养3d。
1.6.2绘制生长曲线
取上述液体种子5mL接种于250mL三角瓶中(内装50mL液体种子培养基),于28℃、120r/min振荡培养。
接种后每天取出一瓶,过滤、收集洗涤菌丝,于80℃烘至恒重,测菌丝干重。
1.6.3制备菌悬液
取液体种子10mL接种于250mL三角瓶中(内装50mL液体种子培养基),为防止菌丝结球在瓶中装入玻璃珠,于28℃、120r/min振荡培养。
无菌操作下取对数生长期的菌丝悬液18mL装入聚丙烯袋中,封口机封口。
1.6.4高压处理
高压时的温度定为25℃(向下浮动范围7℃),做压力与时间双因素试验。
选取压力值为50、100、150、200、250、300、350和400MPa,时间为15、30、45和60min,共32组,以分装好但未加压的菌样为对照。
将分装好的样品放入装水的聚乙烯(PE)袋内封口后放入超高压设备内按照拟订方案进行高压处理。
1.6.5初筛
无菌操作下取高压处理过的菌液3mL于培养皿中(每袋倒6个平皿,以6个平皿的菌落总数作为每个高压条件下样品长出的菌数)。
待培养基(与斜面培养基相同)冷却至约45℃后,倒入平皿中混匀,每个样品倒5个平行样,凝固后置于28℃恒温箱培养。
每天观察,待菌落数稳定后计数,用初筛试剂覆盖菌落表面,28℃恒温箱中培养30min,取出观察,产漆酶菌株周围会出现橙红色显色圈,根据显色圈深浅判断菌株产漆酶能力。
挑选变色深、变色浅和不变色的菌落点种于综合马铃薯培养基平板上继续培养5d,长出较大单菌落后再次重复显色过程,共转5代。
1.6.6复筛
挑取转了5代,变色还较深的菌株接种于试管斜面,由斜面制备液体种子进行发酵培养。
从发酵的第3d开始测酶活,每天测一次到第11d结束。
1.6.7粗酶液制备
发酵液经滤纸过滤,滤液即为粗酶液。
酶活高时用测酶活的缓冲液适当稀释。
1.6.8漆酶活力测定
以愈创木酚作为反应底物[6](465nm处愈创木酚的摩尔吸光系数:
ε465=1.21×104mol-1·L·cm-1),10mL反应混合液中,含8.5mL50mmol/L琥珀酸钠缓冲液(pH4.5),1mL40mmol/L愈创木酚和0.5mL粗酶液,30℃反应30min后,于465nm处测定吸光度。
以灭活的酶液反应混合液为对照。
酶活单位定义:
1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位。
2结果
2.1灵芝和鸡腿菇的生长曲线
从图2可知,灵芝从第1d到第3d菌丝生长旺盛,鸡腿菇从第1d到第4d生长速率最大。
灵芝和鸡腿菇都选取生长2d的菌丝悬液进行高压诱变。
图2灵芝和鸡腿菇生长曲线
Fig.2ThegrowthcurveofG.lucidumKarstandC.ovatus
2.2高压处理灵芝和鸡腿菇的存活率
高压诱变目的不是为了杀死全部微生物,因此把温度固定在菌种生长最适温度附近,研究压力和时间对微生物的影响。
图3表示灵芝在0~250MPa压力范围内各时间的高压处理结果(≥250MPa时所有处理时间的存活率皆为0),图4表示鸡腿菇在0~300MPa压力范围内各时间的高压处理结果(≥300MPa时所有处理时间的存活率都为0)。
从图3、4可看出,这2株菌在处理时间一定时,随着压力升高存活率都在逐渐下降;在压力一定时,随着处理时间的增加存活率也都逐渐下降。
存活率与诱变剂量的关系与传统紫外线及γ射线等物理诱变相似,即存活率随着剂量(压力、时间)的增加而降低。
图3压力和处理时间对灵芝存活率的影响
Fig.3InfluenceofhighhydrostaticpressureandtimeonG.lucidumKarstviability
图4压力和处理时间对鸡腿菇存活率的影响
Fig.4InfluenceofhighhydrostaticpressureandtimeonC.ovatusviability
为研究压力和时间对菌株存活率的影响,进行了方差分析,结果见表1、表2(灵芝≥250MPa时存活率都为0,只计算50~200MPa时的方差;鸡腿菇≥300MPa时存活率都为0,只计算50~250MPa之间的方差)。
由表1可知,时间因素F0.05
由表2可知,时间因素F0>F0.01(3,12),压力因素F0>F0.01(4,12),时间和压力对鸡腿菇存活率的影响都显著。
压力和时间对这2个菌株存活率都有显著影响,相比较而言,压力对存活率的影响更大。
表1对灵芝高压处理时间和压力的方差分析
Tab.1Analysisofvarianceoftimeandpressure(G.lucidumKarst)
方差来源
偏差平方和
自由度
方差
F值
Fa
显著性
时间
1140.725
3
380.242
5.401
F0.05(3,9)=3.86
*
压力
9090.533
3
3030.178
43.044
F0.01(3,9)=6.99
**
误差
633.572
9
70.397
表2对鸡腿菇高压处理时间和压力的方差分析
Tab.2Analysisofvarianceoftimeandpressure(C.ovatus)
方差来源
偏差平方和
自由度
方差
F值
Fa
显著性
时间
1198.112
3
399.371
7.740
F0.01(3,12)=5.95
**
压力
21697.041
4
5424.260
105.123
F0.01(4,12)=5.41
**
误差
619.192
12
51.599
2.3高压突变株的筛选
用愈创木酚作为显色剂,对高压诱变后长出的菌落进行显色。
灵芝和鸡腿菇在50MPa的样品都没有不显色的菌落出现,只有显色深和显色浅的差别。
灵芝在100MPa和150MPa处理15min正突变的频率较大;鸡腿菇在150MPa和200MPa处理15min和30min正突变的频率较大。
压力升高负突变菌株较多,在致死率50%~80%的范围内这2株菌出现正突变的频率较大。
突变后的菌株由于遗传性状发生变化,在一个培养皿中培养,菌株间会产生拮抗线,图5显示灵芝7个突变株间产生的拮抗线。
图5灵芝突变株产生的拮抗线
Fig.5AntagonisticlineproducedbymutantstrainsfromG.lucidumKarst
灵芝挑选变色深的10株、变色浅的8株和未变色的8株进行传代,传5代后有8株显色较深、13株显色浅、5株不显色。
鸡腿菇挑选变色深的15株、变色浅10株和未变色6株进行传代,传5代后有11株显色深、17株显色浅、3株不显色。
图6、7分别表示传代后灵芝和鸡腿菇突变株的显色结果。
图6灵芝突变株的显色情况
Fig.6TheappearingcolorresultofmutantfromG.lucidumKarst
图7鸡腿菇突变株的显色情况
Fig.7TheappearingcolorresultofmutantfromC.ovatus
2.4突变株液体漆酶发酵结果
突变株传代后选变色较深的灵芝4株、鸡腿菇5株分别进行发酵实验,其中漆酶产量最高的G1502和C2003生长及产酶曲线见图8、9。
图8灵芝突变株G1502生长及产酶曲线
Fig.8CurvesofgrowthandlaccaseproductionfromG1502
G0—灵芝出发菌株;G1502—灵芝150MPa处理30min的突变株
G0—originalstrainofG.lucidumKarst;G1502—mutantofG.lucidumKarsttreatedat150MPafor30min
○G0酶活■G1502酶活△G0生物量▼G1502生物量
○laccaseactivityofG0■laccaseactivityofG1502
△biomassofG0▼biomassofG1502
图9鸡腿菇突变株C2003生长及产酶曲线
Fig.9CurvesofgrowthandlaccaseproductionfromC2003
C0—鸡腿菇出发菌株;C2003—鸡腿菇200MPa处理45min的突变株
C0—originalstrainofC.ovatus;C2003—mutantofC.ovatustreatedat200MPafor45min
○C0酶活■C2003酶活△C0生物量▼C2003生物量
○laccaseactivityofC0■laccaseactivityofC2003
△biomassofC0▼biomassofC2003
从图8可知,灵芝出发株发酵8d达到最大酶活(125.48U/mL);其突变株G1502在第7d酶活达到480.17U/mL(提高了2.83倍)。
从图9可知,鸡腿菇出发株发酵9d达到最大酶活(105.98U/mL),其突变株C2003发酵8d达到377.86U/mL(提高了2.57倍)。
根据以上结果,得到2株有应用潜力的超高压诱变株G1502和C2003,其漆酶产量分别比诱变前提高了2.83和2.57倍。
3讨论
3.1实验结果表明,(超)高压是一种新型有效和清洁的物理诱变源,需进一步对其最适诱变条件及诱变机理进行研究。
3.2高压诱变微生物需要把包装材料灭菌再进行菌液分装,以免包装袋上的杂菌对菌液造成污染。
聚乙烯不能进行高温(121℃)灭菌。
采用聚丙烯作为包装材料,可进行高温灭菌,菌液分装后,也易用封口机封口,是进行微生物高压育种的理想包装材料。
3.3影响微生物高压处理的因素有压力、时间、菌龄、培养基成分、温度、pH等[7-9]。
实验证明处于对数生长期的微生物比稳定期和衰亡期的微生物对高压敏感,因此选取对数生长期的菌株进行高压诱变。
培养基营养成分丰富可保护微生物免于高压损伤或有利于损伤后修复,使存活率提高。
与食品微生物灭菌不同,高压诱变育种不是为了杀死全部微生物,应把微生物置于营养较为丰富的培养基中,在最佳生长温度和pH附近进行高压处理。
菌株不同,高压诱变的剂量亦不同。
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Mutageniceffectofultrahighpressureonstrainsproducinglaccase
WANGSui-lou,WUXiao-zong,WANGQiong-bo,LIGuo-fu
(CollegeofFoodandBiologyEngineering,ZhengzhouInstituteOfLightIndustry,Zhengzhou450002)
Abstract:
TheGanoderma.lucidumKarstandCoprinusovatusproducinglaccaseweremutagenizedbyultrahighpressure.Withincreasementofdose,theirdeathrateincreasedtoo.Theresultsofmutagenesiswerebetterwithintherangeofdeathratefrom50%to80%.Twopotentialmutantstrainswereobtainedbythisexperiment.TheG1502derivedfromG.lucidumKarsthadalaccaseactivityof2.83timeshigherthanthatoftheoriginalstrain.TheC2003derivedfromC.ovatushadtheenzymeactivityof2.57timeshigherthanthatoftheoriginalstrain.Theincubationtimeofthesetwomutantstrainswas1dayshorterthanthatofbothoriginalstrains,respectively.
Keywords:
Ultrahighpressure;Ganoderma.lucidumKarst;Coprinusovatus;laccase
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